北京航空航天大學研發(fā)可解析肺癌細胞基因突變的納米芯片

近日，國際癌癥研究機構（IARC）報告了全球最新癌癥數(shù)據(jù)：每新增 4 名癌癥患者，就有 1 名來自中國，每分鐘有將近 8 名中國人確診患癌。

對腫瘤患者來說，一旦腫瘤細胞出現(xiàn)特殊行為，細胞就有可能出現(xiàn)超強耐藥性，這時無論服用再昂貴的藥物，也可能是無濟于事。

研究發(fā)現(xiàn)，特定細胞的基因發(fā)生突變，往往是導致上述現(xiàn)象的主要原因。因此，在單細胞水平上，研究活細胞行為和基因突變的相關性，可幫助提供更精準可靠的臨床治療參考。

基于此，北京航空航天大學常凌乾課題組開發(fā)出一種新型單個活細胞水平研究平臺（Single Living Cell Analysis Nanoplatform，下稱 SLCA 平臺），借助納米電遞送技術，該平臺可將一種用于原位信號放大的多米諾熒光探針，高效遞送到活細胞內，從而在單細胞水平檢測細胞內的基因突變。

同時，該研究中基于微孔陣列的納米芯片，擁有細胞尋址的能力，它能對腫瘤細胞進行耐藥性原位分析。

4 月 8 日，Nano Letters 刊登了相關論文，論文題為 “Single Living Cell Analysis Nano-platform for High-throughput Interrogation of Gene Mutation and Cellular Behavior” 《用于基因突變和細胞行為高通量探測的單個活細胞分析納米平臺》，并成為 Nano Letters 內封面文章。

其中，常凌乾擔任通訊作者，第一作者是北航生物醫(yī)學工程高精尖創(chuàng)新中心和生物醫(yī)學工程學院董再再博士。

研發(fā)多米諾 DNA 探針，比同類工具反應速度快 4 倍

常凌乾團隊利用 SLCA 平臺對肺癌患者臨床樣品進行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)肺癌細胞的 EGFR 基因突變和相關靶向藥物耐受性之間，存在明顯的正相關性。

也就是說，細胞對靶向藥的敏感程度、和引起肺癌的某些基因突變細胞，呈現(xiàn)出比例上的正相關性。

因此，SLCA 平臺可為細胞內基因檢測和單細胞分析提供一種通用方法，并有望大范圍用于指導臨床精準治療。

據(jù)了解，在肺癌基因突變中，EGFR（epidermal growth factor receptor）作為表皮生長因子受體家族的成員之一，其發(fā)生突變的存在率最高。

雖然 EGFR 靶向藥物可以延長肺癌患者存活期，但腫瘤細胞容易產(chǎn)生耐藥性，而這會導致靶向藥物失效。

因此，預估患者體內是否發(fā)生 EGFR 突變，并借此推斷患者的腫瘤細胞對于靶向藥物的耐藥性，可有效提高肺癌治療效果。

研究中，常凌乾團隊設計出一種 DNA 探針，名字叫 Domino（下稱多米諾）。通過堿基互補配對的原則，這只探針可把成對的發(fā)夾 DNA 序列，組裝成致密的螺旋鏈。

與靶 RNA 孵育后，多米諾探針會在 30 分鐘內快速反應，并使其熒光倍率增強，最終實現(xiàn)在單細胞內具有較強的熒光檢測信號。

在目標 RNA 存在的情況下，由于鏈在螺旋方向上的鏈置換反應，多米諾探針被迅速觸發(fā)，并在 30 分鐘后，熒光強度會達到飽和。

與傳統(tǒng)的分子探針相比，多米諾探針的反應速度快了 4 倍，并能將熒光信號放大 12.5 倍。

為了實現(xiàn)高效、且安全的探針傳遞，同時允許在單細胞水平上、對細胞行為進行原位觀察，常凌乾課題組開發(fā)出一種納米芯片，該芯片可將多米諾探針傳遞到活細胞中，并可在芯片上進行細胞培養(yǎng)與觀察。

如下圖所示，從上到下來看，該納米芯片由三個部件組成：分別是用于細胞定位和培養(yǎng)的微孔陣列、用于探針輸送的納米孔、以及用于建立電場的電極。

圖 | 納米芯片結構（來源：受訪者）

其中，這些微孔陣列膜可被分為上腔和下腔，相關細胞和多米諾探針均會通過帶有納米孔的微孔陣列膜。

數(shù)以百萬計的單細胞排列在微孔陣列中，并與微孔底部的納米孔緊密相連。在外部低電壓下，納米孔會聚集電場，并在納米孔之間形成偏置電壓，從而穿透細胞膜。

通過使用此方法，可以巧妙避免同電荷細胞膜與多米諾探針之間的斥力問題，還能在可調節(jié)的電場下實現(xiàn)單細胞膜上的精確電穿孔，可控、高效、均勻地將多米諾探針傳遞進細胞。

此外，在芯片上，每個微孔都有一個唯一的地址，這樣就能聯(lián)合多米諾探針檢測并追蹤微孔中的每個細胞。

由于這些癌細胞都位于可尋址微孔中，因此在遞送之后，可實現(xiàn)細胞里的 EGFR 基因突變檢測，以及后續(xù)的耐藥性分析。

另據(jù)悉，在不同濃度的目標 RNA 存在下，熒光強度會隨著目標 RNA 濃度的增加而增強，并在 100 pM?100 nM 范圍內呈線性關系，這表明多米諾探針具備識別靶 RNA 的高特異性。

相比傳統(tǒng)的分子信標（Molecular beacon，一種熒光標記的寡核苷酸鏈，但沒有熒光信號放大功能），在同樣條件下，多米諾探針明顯增加了輸出熒光，它的檢出限比傳統(tǒng)分子信標低 100 倍，這說明多米諾探針在敏感的基因突變檢測方面，具備一定優(yōu)勢。

為了對樣品進行平行測試，團隊在一個芯片上設計了三個平行的模塊，每個芯片單元在聚碳酸酯納米膜上制備有 10000 個微孔，從而實現(xiàn)高通量的細胞分析。

每個微孔只有 20μm 大小，為的是能適應大多數(shù)細胞的尺寸。研究中，他們采用納米孔直徑為 800nm 的納米孔膜，將電場定位到細胞膜上，隨后通過穿孔細胞膜，并利用電泳方式，將多米諾探針送到細胞中。

為了定位芯片上的每個單元，納米孔膜上的微孔被劃分成一個個 10×10 微孔的方形陣列，并使用數(shù)字進行標記。

例如，標記為 “4?9_J-5” 的微孔，位于納米孔膜的第四行和第九列。也就是說，即使芯片被重新安置，任何單個細胞也都能被尋址。

此外，當這些細胞排列成大規(guī)模的規(guī)則陣列，也可為后續(xù)基因分析和細胞行為的跟蹤，提供精確的單細胞分析平臺。

即使在 10V 的低電壓下，多米諾探針也能穿透細胞膜。另外，常凌乾團隊還比較了單個細胞在不同微孔和 BEP 中的跨膜電位。

由于微孔所提供的環(huán)境是均勻的，因此微孔中的細胞具備幾乎相同的跨膜電位，相比傳統(tǒng)的電穿孔方法（bulk electroporation），優(yōu)勢非常明顯。

這一結果表明，基于微孔陣列的導電納米芯片，能為每個細胞提供均勻分布的電場，這對于微孔中細胞的均勻電穿孔是非常必要的，也是實現(xiàn)多米諾探針均勻導電的前提條件。

研究中，常凌乾團隊分別選取了三種類型的肺癌細胞 H1975、HCC827 和 A549，來作為 EGFR L858R 突變陽性、EGFR 19 外顯子缺失突變陽性、以及 EGFR 突變野生型的模型。

考慮到高檢測信號和低細胞損傷的要求，他根據(jù)多米諾探針和碘化丙啶在細胞中的熒光強度，確定了 10 V 和 200 個脈沖作為最佳電傳遞條件。

他們發(fā)現(xiàn)，用電遞送納米芯片將多米諾探針注入細胞，30 分鐘內突變細胞就會變亮。這些結果證實，組裝的多米諾探針在不影響累積率的情況下，實現(xiàn)了細胞內目標 RNA 的熒光檢測。

流式細胞儀的結果也表明，本次研究中的納米平臺，可區(qū)分 90% 以上的突變陽性細胞。

考慮到所有細胞都可以在微孔陣列上直接被觀察到的特性，常凌乾團隊對變亮的細胞進行計數(shù)，得出突變陽性細胞的比例。

對比后他們發(fā)現(xiàn)，細胞的突變陽性率與流式細胞儀計數(shù)的結果一致，這表明該納米平臺具有高通量、單細胞分辨率的基因分析能力。

為了獲得較高的加載效率，該團隊還應用一種基于真空的設置，來將細胞加載到微孔中，從而讓細胞效率達到 85% 以上。

此納米平臺的遞送效率和細胞活性均達到 90% 以上，這也表明它在活細胞操作、探針遞送和細胞行為分析方面，具有很高的可行性和良好的性能。

概括來說，該研究工作研發(fā)了一種納米生物芯片，在原位進行高通量活細胞培養(yǎng)，并在活細胞內探測突變基因，以及時空可控的分析同一細胞行為。未來有望能通過技術轉化，應用于臨床藥物篩選和精準醫(yī)療。這也是常凌乾從事科研的一個長期愿景。

談及未來，他告訴 DeepTech，國家十四五規(guī)劃已明確將單細胞技術、創(chuàng)新藥物作為優(yōu)先發(fā)展領域。能在單細胞精度解析細胞的技術，是未來生物技術領域的重點之一。他們課題組將繼續(xù)致力于設計新型的可以在單細胞精度上操控和改造細胞的新技術，并為未來能直接應用于臨床診斷和在體治療而奮斗。

原文標題：每分鐘8名中國人確診患癌！北航教授研發(fā)納米芯片，30分鐘即可解析肺癌細胞基因突變 | 專訪

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責任編輯：haq