適合活細(xì)胞的超分辨顯微技術(shù)——結(jié)構(gòu)光照明顯微成像

克服光學(xué)衍射極限，觀察到亞細(xì)胞尺度的生物結(jié)構(gòu)和變化過(guò)程一直是生命科學(xué)研究的目標(biāo)之一，也是超分辨顯微鏡誕生的目的所在。隨著現(xiàn)代顯微成像技術(shù)的發(fā)展和不斷突破，超分辨顯微成像大家庭也一直在補(bǔ)充新鮮血液。不過(guò)，這些形形色色的技術(shù)各自也都存在著不足：譬如前面幾期中我們提到的 PALM/ STORM/DNA-PAINT 等單分子定位技術(shù)都需要長(zhǎng)時(shí)間的多幀采集，并需要高功率激發(fā)光。這意味著它們?cè)诤艽蟪潭壬喜贿m合對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行成像。

在超分辨顯微成像專(zhuān)題的最后一期中，我們將為大家介紹一種完全不同的，適合活細(xì)胞的超分辨顯微技術(shù)——結(jié)構(gòu)光照明顯微成像（Structure Illumination Microscopy, SIM）。

SIM 的原理

SIM 最早是在2005年由 Mats Gustafsson 開(kāi)發(fā)并提出的，其基本原理是基于莫爾條紋（Moire pattern）——一種常用于產(chǎn)生光學(xué)錯(cuò)覺(jué)的效應(yīng)。

莫爾條紋：由兩個(gè)空間頻率相近的周期性光柵圖形疊加而形成的光學(xué)條紋。當(dāng)兩條線或兩個(gè)物體之間以恒定的角度和頻率發(fā)生干涉，而人眼無(wú)法分辨這兩條線或兩個(gè)物體時(shí)，只能看到干涉的花紋。

這個(gè)概念聽(tīng)起來(lái)有點(diǎn)高深，但其實(shí)莫爾條紋是一種我們?cè)谏钪须S處可見(jiàn)的現(xiàn)象（圖1）。大家可以翻翻看自己穿著條紋襯衫的照片，說(shuō)不定就能看到莫爾條紋的身影哦。

圖1 生活中的莫爾條紋

從圖2我們可以更加直觀地了解莫爾條紋是如何用于顯示高頻信息的：當(dāng)兩個(gè)小尺寸（高頻）網(wǎng)格疊加覆蓋在最右邊的圖像中時(shí)，它們之間發(fā)生干涉后就會(huì)顯示一個(gè)較大尺寸（低頻）的網(wǎng)格，這個(gè)網(wǎng)格會(huì)包含兩個(gè)較小網(wǎng)格的信息。

圖2 兩個(gè)相互成一定角度重疊的細(xì)網(wǎng)格相互干涉形成的莫爾條紋。From Wikimedia commons

在實(shí)際使用時(shí)，通過(guò)在照明光路中插入一個(gè)結(jié)構(gòu)光的發(fā)生裝置（如光柵，空間光調(diào)制器，或者數(shù)字微鏡陣列DMD等），照明光受到調(diào)制后，形成亮度規(guī)律性變化的圖案，然后經(jīng)物鏡投影在樣品上，調(diào)制光所產(chǎn)生的熒光信號(hào)再被相機(jī)接收。通過(guò)移動(dòng)和旋轉(zhuǎn)照明圖案使其覆蓋樣本的各個(gè)區(qū)域，并將拍攝的多幅圖像用軟件進(jìn)行組合和重建，就可以得到該樣品的超分辨率圖像了。由于需要組合多個(gè)圖像，SIM 的成像過(guò)程是需要一定時(shí)間的，不過(guò)遠(yuǎn)比STORM這樣的單分子定位超分辨顯微技術(shù)要快許多。

還有一種速度更快的SIM技術(shù)——iSIM（Instant SIM）。它的前身是多焦點(diǎn)SIM（multifocal SIM，mSIM）。mSIM結(jié)合了共聚焦和結(jié)構(gòu)光照明——不是用線，而是用多個(gè)稀疏的光點(diǎn)排列成圖案進(jìn)行照明（圖2）。這些焦點(diǎn)由微透鏡形成，并與發(fā)射光路徑上的針孔相結(jié)合，達(dá)到光學(xué)切片的效果。微透鏡陣列可以對(duì)來(lái)自每個(gè)照明焦點(diǎn)圖像進(jìn)行2倍的光學(xué)收縮，然后通過(guò)振鏡將帶有圖案的激發(fā)光投射到整個(gè)樣品上進(jìn)行成像。Curd 等人在文章詳細(xì)說(shuō)明了構(gòu)建iSIM系統(tǒng)的過(guò)程（Curd et al., 2015.）。

iSIM 不同于 mSIM 的地方在于，它可以通過(guò)微透鏡陣列和掃描振鏡直接組合多個(gè)位置的圖像，不需要通過(guò)軟件，從而大大提高了速度，并減少了相機(jī)噪聲的影響。與PALM/STORM 等技術(shù)相比，iSIM 的速度能提高100倍。與其它結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)相比，iSIM 對(duì)樣品的穿透能力要高上10倍，并且具有比轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦更好的光學(xué)切片能力，這樣一來(lái)，后期反卷積處理的效果也非常好。

圖3 產(chǎn)生多焦點(diǎn)激發(fā)的會(huì)聚微透鏡陣列。激發(fā)樣品后，用與微透鏡陣列匹配的針孔陣列抑制非焦平面的雜散光。借助于第二個(gè)微透鏡陣列，每個(gè)針孔發(fā)射的熒光可實(shí)現(xiàn)2倍收縮。振鏡用于光柵多焦激發(fā)和和收集多焦發(fā)射光，在每次曝光期間產(chǎn)生超分辨率圖像（為清晰起見(jiàn)，本圖僅顯示部分振鏡）。（York et al., 2013）

左：原始圖像。右：左圖的動(dòng)畫(huà)示意。

SIM 的應(yīng)用

SIM 和 iSIM 可以將傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率極限降低一半，更重要的是能夠?qū)罴?xì)胞進(jìn)行超分辨成像。iSIM 能夠以高達(dá) 100Hz 的頻率采集圖像，并且具有更好的光學(xué)切片能力。這使得 iSIM 能夠在使用傳統(tǒng)熒光染料的同時(shí)，對(duì)生物結(jié)構(gòu)內(nèi)部進(jìn)行3維時(shí)間序列的超分辨成像。從而讓研究人員可以突破光學(xué)分辨率極限，觀察細(xì)胞和組織內(nèi)微觀結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。

圖4將 iSIM 與其他活細(xì)胞成像技術(shù)（轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦，線掃描共聚焦）的分辨率進(jìn)行了比較。這個(gè)樣品的挑戰(zhàn)是線粒體內(nèi)部空隙中沒(méi)有 Mcherry 表達(dá)，因此只有用 iSIM 才能實(shí)現(xiàn)超分辨（圖c中用白色箭頭所示）。

圖4 表達(dá) TFAM-GFP（綠色）和 Tom20-mCherry（紫色）的MRL-TR轉(zhuǎn)化人肺成纖維活體細(xì)胞。圖a-c用iSIM拍攝，d-f用轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦拍攝，g-i用線掃描共聚焦顯微鏡拍攝。（York et al., 2013）

圖a, d, g所示為3 μm體素的最大強(qiáng)度投影（XY），高倍圖顯示的為白色箭頭指示區(qū)域在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的圖像。

圖b, e, h: a, d, g高倍圖中白色矩形區(qū)域的高倍放大。Scalebars: 0.5μm

圖c, f, i: a, d, g中黃線指示的~270 nm切片的軸向（ZY）視圖。Scalebars: 1μm

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的運(yùn)動(dòng)和生長(zhǎng)非常迅速，新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管的形成和生長(zhǎng)發(fā)生在約100ms的時(shí)間尺度上，iSIM 能夠非常清楚地捕捉到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的生長(zhǎng)過(guò)程（圖5）。

圖5 iSIM拍攝的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)動(dòng)力學(xué)圖像（100Hz）（Yorket al., 2013）

A：200個(gè)時(shí)間序列中的第一張圖像，顯示了在MRL-TR轉(zhuǎn)化人肺成纖維細(xì)胞內(nèi)GFP-Sec61A標(biāo)記的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Scalebar：10 μm

B：A中白色大矩形區(qū)域的放大圖像。白色箭頭指示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管的生長(zhǎng)，藍(lán)色指示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管的重塑。Scalebar：5 μm

C：A中白色小矩形的放大圖像，140ms內(nèi)新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管形成過(guò)程。Scalebar：200 nm

使用iSIM，York等人還成功地對(duì)3日齡斑馬魚(yú)紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了活體成像（圖6），避免了由于運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的圖像模糊。展示出了對(duì)活樣品生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行無(wú)創(chuàng)成像的能力。

圖6 上：100個(gè)2D圖像（2673ms）的最大強(qiáng)度投影。顯示3日齡斑馬魚(yú)胚胎腦部血細(xì)胞中GFP標(biāo)記的微管。成像深度：20μm；運(yùn)動(dòng)方向：從左到右，清晰的細(xì)胞邊界顯示沒(méi)有由于運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的圖像模糊。Scalebar：10μm

下：上圖中紅色方框在特定時(shí)間的圖像。黃色箭頭：同一細(xì)胞末端的“尾巴”結(jié)構(gòu)；黃色小箭頭：尾部的微管；紅色箭頭：細(xì)胞內(nèi)的微管。Scalebar：2μm。

適合 SIM 的科學(xué)相機(jī)

SIM 常用于進(jìn)行高時(shí)間分辨率的活體超分辨成像，高速的 sCMOS相機(jī)是它們的最佳搭檔。另一方面，由于曝光時(shí)間短，SIM對(duì)相機(jī)采集信號(hào)的能力要求也比較高。

因此，背照式sCMOS相機(jī)是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，如Prime BSI,Prime BSI express,Prime 95B等。95%量子效率帶來(lái)的高靈敏度，再加上低讀出噪聲，可以在提高采集速度的同時(shí)保證圖片信噪比。另外，均勻的背景對(duì)SIM和iSIM這種靠結(jié)構(gòu)光照明來(lái)實(shí)現(xiàn)超分辨成像的技術(shù)來(lái)說(shuō)也很重要。

審核編輯 ：李倩