miRNA是一類小分子量的非編碼RNA片段,通過與靶向mRNA結(jié)合,發(fā)揮基因沉默和翻譯抑制的功能。miRNA通過調(diào)控生物體一系列的生長(zhǎng)發(fā)育過程,可以幫助生物體應(yīng)對(duì)各種各樣的環(huán)境變化,維持正常的生命活動(dòng)。因此,理解miRNA的發(fā)生調(diào)控過程,尤其是miRNA在不同組織、不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期、不同生理狀態(tài)時(shí)的含量,顯得尤為重要。
納米孔檢測(cè)技術(shù)作為20世紀(jì)90年代中期發(fā)展至今的一種分析手段,因?yàn)槠錈o標(biāo)記、高靈敏等優(yōu)勢(shì),已經(jīng)逐漸成為化學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)一種重要的單分子級(jí)別的分析檢測(cè)方法。而基于納米孔的核酸分析是納米孔檢測(cè)領(lǐng)域中最成功的方向,尤其是基于納米孔測(cè)序方法開發(fā)的第三代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域的研究中。因此,納米孔檢測(cè)技術(shù)有望在miRNA的分析檢測(cè)中做出獨(dú)特的貢獻(xiàn)。
近期,來自東京農(nóng)工大學(xué)的Ryuji Kawano教授在JACS Au上發(fā)表了題為“Pattern Recognition of microRNA Expression in Body Fluids Using Nanopore Decoding at Subfemtomolar Concentrations”的文章,提出了一種使用發(fā)夾DNA探針的miRNA檢測(cè)方法,理論上實(shí)現(xiàn)了膽管癌樣本中阿摩爾水平(10?1?M)的miRNA檢測(cè)。
研究人員使用的實(shí)驗(yàn)裝置如圖1a、b所示,選擇miR-193、miR-106a、miR-15a、miR-374和miR-224作為靶標(biāo)miRNA,因?yàn)檫@些miRNA已經(jīng)被報(bào)道在人的膽管癌細(xì)胞中過表達(dá)。接下來,研究人員設(shè)計(jì)了一條可以與這五種miRNA互補(bǔ)配對(duì)的5’端含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的單鏈DNA-HP-dgDNA(圖1c),HP-dgDNA和miRNA配對(duì)后的熱力學(xué)模擬結(jié)構(gòu)如圖1d所示。當(dāng)與miRNA雜交的HP-dgDNA通過αHL納米孔時(shí),互補(bǔ)配對(duì)的雙鏈區(qū)域在電壓驅(qū)動(dòng)下發(fā)生解旋,且解旋時(shí)間隨著互補(bǔ)配對(duì)位置個(gè)數(shù)減少而減少(圖1e),因此,可以通過雜交鏈的解旋過孔時(shí)間來大致判斷有幾種miRNA與HP-dgDNA發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)。
為了驗(yàn)證該檢測(cè)方法的可行性,研究人員首先使用合成miRNA分別制備了膽管癌miRNA樣品(存在5種miRNA)和兩種健康的miRNA樣品(存在1或3種miRNA)。三種樣品分別與HP-dgDNA雜交,含1種(圖2a)、3種(圖2b)或5種(圖2c)miRNA樣品的過孔時(shí)間如圖所示。其統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2d所示,可以看到含有3種或5種miRNA互補(bǔ)的雜交鏈解旋過孔時(shí)間明顯長(zhǎng)于只含1種miRNA的過孔時(shí)間,五類只含1種miRNA的雜交鏈過孔時(shí)間也在統(tǒng)計(jì)上存在一點(diǎn)區(qū)分(圖2d,f),并且所有含miRNA的雜交鏈的過孔時(shí)間都大于HP-dgDNA單鏈的過孔時(shí)間(圖2e)。同時(shí),根據(jù)模擬的結(jié)果,研究人員還發(fā)現(xiàn)雜交鏈過孔時(shí)間是隨著雜交鏈解旋所需能量增大而延長(zhǎng)的(圖2g)。研究人員在圖2中驗(yàn)證了可以利用雜交鏈解旋過孔的時(shí)間差異來區(qū)分與HP-dgDNA雜交的miRNA數(shù)量差異,從而匯報(bào)出樣品中miRNA大致的種類。
在驗(yàn)證了方法的可行性后,研究人員測(cè)試了該方法針對(duì)臨床樣本的有效性。盡管miR-15a、miR-193、miR-224、miR-106a和miR-374這五種miRNA已經(jīng)被報(bào)道在膽管癌患者中過表達(dá),研究人員仍然先使用RT-qPCR對(duì)從血漿樣品中提取的miRNA進(jìn)行定量(圖3a,b),可以發(fā)現(xiàn)相較于健康人而言,癌癥患者中這五種miRNA的表達(dá)量都較高,其中miR-193,miR-106a和miR-15a的表達(dá)量顯著高于健康水平。隨后,研究人員使用納米孔傳感了從血漿中提取的miRNA與HP-dgDNA的雜交鏈(圖3c),可以看到癌癥患者中提取到的miRNA與HP-dgDNA形成雜交鏈的解旋過孔時(shí)間(1487ms)明顯長(zhǎng)于健康人(856ms)提取到的miRNA雜交鏈的過孔時(shí)間(圖3e,f)。圖3說明了可以根據(jù)雜交鏈的過孔時(shí)間來區(qū)分癌癥患者與健康人的miRNA表達(dá)量差異。
最后,研究人員探究了該方法理論上的檢測(cè)限。分別使用0.1、1、10和100fM的miRNA與500nM HP-dgDNA雜交(圖4b,c),可以發(fā)現(xiàn)小于100fM的miRNA雜交鏈過孔時(shí)間隨著濃度提高而增加,且都大于僅存在HP-dgDNA單鏈的過孔時(shí)間(圖4f)。因此,研究人員認(rèn)為只要miRNA雜交鏈的過孔時(shí)間稍大于HP-dgDNA單鏈的過孔時(shí)間都可以被認(rèn)為實(shí)現(xiàn)了檢測(cè),通過理論計(jì)算可以得到該方法的理論檢測(cè)限為0.3fM。
該論文一經(jīng)發(fā)表就受到領(lǐng)域的廣泛關(guān)注,上線不到一個(gè)月時(shí)間Altmetric指標(biāo)就達(dá)到了92,但是不可否認(rèn)的是,相較于如此高的關(guān)注度,該方法仍然有很多問題亟待解決,如:1)過時(shí)間被判斷為可區(qū)分的差異程度沒有定義,很多擬合峰相互重合;2)血漿中提取miRNA是否會(huì)因?yàn)槌诉@五種miRNA以外的其他miRNA與單鏈DNA部分互補(bǔ)從而影響了過孔時(shí)間;3)癌癥患者的過孔時(shí)間統(tǒng)計(jì)分布與健康人基本相同,該方法對(duì)患者之間的差異對(duì)疾病診斷的影響。
作者:Nanami Takeuchi, Moe Hiratani, and Ryuji Kawano*
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原文標(biāo)題:納米孔檢測(cè)技術(shù)實(shí)現(xiàn)膽管癌樣本中阿摩爾水平miRNA表達(dá)的模式識(shí)別
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