C1qhi單核細(xì)胞在BD中的促炎作用

貝赫切特?。˙ehcet’s disease，BD），又名白塞病，是一種慢性血管炎，通常表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性口腔/生殖器潰瘍和皮膚病變，以全身免疫異常為特征。然而，目前還缺乏對BD發(fā)病機(jī)制的全面了解。研究者對BD患者和健康供血者的外周血單個核的細(xì)胞（PBMCs） 進(jìn)行了單細(xì)胞測序和Bulk RNA測序并對分離出的單核細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞測序。研究者觀察到BD患者外周血單個核的細(xì)胞中單核細(xì)胞不僅在數(shù)量上會顯著增加而且細(xì)胞內(nèi)部也存在明顯的轉(zhuǎn)錄變化。數(shù)據(jù)分析顯示，BD中C1q-high單核細(xì)胞（C1qhi）顯著富集；擬時序分析表明，BD單核細(xì)胞明顯地將其分化向伴隨炎癥和C1qhi單核細(xì)胞的軌跡轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步的實驗表明，C1qhi單核細(xì)胞可增強(qiáng)吞噬和促炎細(xì)胞因子分泌，并且該亞型具有顯著的臨床相關(guān)性。在機(jī)制上，激活的干擾素-γ （IFN-γ）信號在BD患者中誘導(dǎo)C1qhi單核細(xì)胞增多，而tofacitinib治療可使C1qhi單核細(xì)胞減少。該研究闡明了BD的免疫情況和C1qhi單核細(xì)胞對BD炎癥增加的重要性，這使它們可作為治療靶點和疾病的臨床評估指標(biāo)。

1、BD中外周血單個核細(xì)胞的單細(xì)胞測序情況

研究者對4例未接受治療的BD患者和4例健康對照人（HCs）的PBMCs進(jìn)行了單細(xì)胞測序（圖1A）。共檢測出36190個高質(zhì)量的細(xì)胞，并從5個主要細(xì)胞系中的得到了20個細(xì)胞群（圖1B），包括髓系細(xì)胞（CD33+）、T細(xì)胞（CD3D+）、自然殺傷細(xì)胞（NK） （KLRF1+）、B細(xì)胞（CD79A+）和非免疫細(xì)胞系（PPBP+）（圖1C，1D）。研究者進(jìn)一步進(jìn)行了細(xì)胞亞群分析：確定了四種髓系細(xì)胞亞型 （圖1E），包括CD14+單核細(xì)胞（LYZ+CD14+），CD16+單核細(xì)胞（LYZ+FCGR3A+），常規(guī)樹突狀細(xì)胞（cDCs;CD1C+CLEC10A+），漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDCs;LILRA4 + CLEC4C +）；8種T細(xì)胞亞型，即新生的CD4 T細(xì)胞（CD4 T naive;CD3D+ CCR7+），記憶CD4 T細(xì)胞（CD4 Tmemory;CD3D+ CD40LG+），IFN相關(guān)的CD4 T細(xì)胞（CD4 T與IFN相關(guān);CD3D+ISG15+）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs;CD3D+ FOXP3+），先天性的T細(xì)胞（先天性淋巴細(xì)胞;CD3D+ CD127+ KLRG1+ SLC4A10+），記憶CD8 T細(xì)胞（CD8 Tmemory;CD8A+ GZMK+），效應(yīng)CD8 T細(xì)胞（CD8 Teffector;CD8A+ GZMB+）、增殖T細(xì)胞（增殖T;CD3D+ MKI67+）。

圖1. BD患者和健康供體外周血單個核細(xì)胞的單細(xì)胞測序圖譜

2、單核細(xì)胞參與BD的系統(tǒng)免疫畸變

研究者整合了scRNA-seq（4例BD患者和4例HCs）與Bulk RNA-seq（9例BD患者和10例HCs）的數(shù)據(jù)。從Bulk RNA-seq數(shù)據(jù)中研究者鑒定出了BD中有1，514個上調(diào)和325個下調(diào)的差異表達(dá)基因（DEGs）（圖2A）。他們將這些DEGs與scRNA-seq數(shù)據(jù)中確定的細(xì)胞類型進(jìn)行映射，并發(fā)現(xiàn)上調(diào)的DEGs在單核細(xì)胞和DCs中相對富集（圖2B），而下調(diào)的基因在B細(xì)胞中富集（圖2C）。研究者們還發(fā)現(xiàn)：BD患者單核細(xì)胞比例高于HCs（圖2D），全血細(xì)胞計數(shù)數(shù)據(jù)也進(jìn)一步證實了這一點（圖2E），這表明單核細(xì)胞在BD中起著重要的作用。隨后，研究者使用scRNA-seq數(shù)據(jù)研究了主要細(xì)胞系中與BD進(jìn)展相關(guān)的生物學(xué)途徑。在單核細(xì)胞中，最主要的途徑是IFN-γ反應(yīng)、外源性抗原的加工和遞呈以及中性粒細(xì)胞的激活（圖2F和G）。

圖2. BD患者PBMCs中的單核細(xì)胞異常

3、單核細(xì)胞異質(zhì)性的鑒定

接下來研究者對4名BD患者和4名HCs的PBMCs進(jìn)行磁珠分選單核細(xì)胞（CD14+），并進(jìn)行了scRNA-seq。共得到39385個高質(zhì)量的單核細(xì)胞，進(jìn)一步分析得到了8個細(xì)胞群 （圖3A）。然后，研究者通過評估高表達(dá)基因和相應(yīng)的富集通路來比較單核細(xì)胞所有8個亞型的功能表型（圖3B）。8個單核細(xì)胞亞型中有5個存在CD14高表達(dá)（圖3C）。在CD14低表達(dá)的3個亞型中，CD16 high單核細(xì)胞（CD16Monos）呈現(xiàn)非經(jīng)典單核細(xì)胞標(biāo)記物（FCGR3A、MS4A7和CX3CR1），單核細(xì)胞來源的DC （MoDCs）呈現(xiàn)過表達(dá)抗原遞呈途徑和DC特異性基因標(biāo)記物 （CLEC10A、FCER1A、CST3和CD74）。C1qhi單核細(xì)胞（C1Q Monos）高表達(dá)補體1q （C1Q基因，包括C1QA、C1QB和C1QC）和巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（CD68）（圖3C）。接下來，研究者研究了與BD相關(guān)的單核細(xì)胞組成的差異。對比BD組和HC組的相對細(xì)胞比例，他們觀察到BD患者C1Q Monos明顯增加，MoDCs明顯減少（圖3D）。通過流式細(xì)胞術(shù)，他們觀察到該亞型的存在，并驗證了BD患者的C1Q單核細(xì)胞數(shù)量（scRNA-seq數(shù)據(jù)中的C1Q單核細(xì)胞數(shù)量）增加（圖3E、F）。

圖3. BD中單核細(xì)胞的異質(zhì)性

4、向C1qhi單核細(xì)胞分化的軌跡伴隨著炎癥 為了探索單核細(xì)胞亞型之間的軌跡關(guān)系，研究者又做了細(xì)胞軌跡分析。擬時序軌跡軸從MHC-IIMonos分叉為兩個末端：fate 1， C1Q Monos和fate 2， MoDCs（圖4A和B）。但這兩種分布顯著不平衡，BD單核細(xì)胞在命運1末端聚集，而HC單核細(xì)胞在命運2末端聚集（圖4C）。這一結(jié)果與BD中C1Q單核細(xì)胞增多和MoDCs信號減少相對應(yīng)（圖3D）。研究者又研究了兩種分化軌跡下的相關(guān)基因表達(dá)譜和通路。結(jié)果顯示：編碼炎癥細(xì)胞因子相關(guān)蛋白的基因（ISG15、TNFRSF1B和S100A11）和補體成分（C1q基因）沿著fate 1逐漸上調(diào)（圖4D）。相反，fate 2顯示出抗原呈遞基因的變異，包括MHC-II基因（HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ）、免疫球蛋白E受體Fc片段（FCER1A和FCER2B）和DC標(biāo)記（CLEC10A、CD1C和CD74）（圖4E）。途徑富集分析發(fā)現(xiàn)，fate 1與炎癥相關(guān)通路相關(guān)，如趨化因子信號通路、核苷酸寡聚化域（NOD）樣受體信號通路和NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，而fate 2與抗原呈遞相關(guān)通路相關(guān)。參與單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化（RHOC， NR4A1和MAFB）的轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的表達(dá)在fate 1中逐漸增加，最終形成巨噬細(xì)胞樣亞型（C1Q Monos），但在fate 2中沒有，最終形成MoDCs亞型（圖4G）。

圖4. 單核細(xì)胞亞型的分化軌跡

5、C1Q單核細(xì)胞參與BD的高炎癥反應(yīng)

為了測試C1Q單核細(xì)胞是否具有促炎特性，研究者分析了單核細(xì)胞的三個關(guān)鍵炎癥調(diào)節(jié)能力，包括吞噬、抗原呈遞和細(xì)胞因子分泌。C1Q單核細(xì)胞比其他亞型具有更大的功能（圖5A），這是由BD相關(guān)的促炎細(xì)胞因子（TNF和IL6）、FcR激活因子（LYN和HCK）、細(xì)胞骨架重塑因子（PIK3CG、WASP2和VASP）和MHC-II成分的過表達(dá)引起。接下來，研究者檢測了單核細(xì)胞的吞噬能力。結(jié)果表明：BD C1qhi單核細(xì)胞比CD16+單核細(xì)胞和CD16單核細(xì)胞吞噬更多右旋糖酐（圖5 B、C）。他們進(jìn)一步檢測了脂多糖（LPS）刺激的單核細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生情況，并觀察到BD C1qhi單核細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6和TNF-α水平顯著高于CD16+單核細(xì)胞或CD16－單核細(xì)胞（圖5 D-G）。

圖5. C1qhi單核細(xì)胞表現(xiàn)出促炎的特性

6、激活的IFN-γ信號刺激了BD中C1qhi單核細(xì)胞的擴(kuò)增

為了了解BD中C1qhi單核細(xì)胞擴(kuò)增的潛在機(jī)制，研究者首先分析了BD和HC之間C1qhi單核細(xì)胞的DEGs，并確定了BD中254個上調(diào)基因和115個下調(diào)基因。上調(diào)的基因在IFN-γ應(yīng)答通路中顯著富集（圖6A）。接下來，研究者做了SCENIC分析，并注意到調(diào)節(jié)IFN-γ反應(yīng)途徑的轉(zhuǎn)錄因子（TranscriptionFactor，TF）的顯著富集，包括STAT1和IRF1（圖6B），這些TF的表達(dá)也在BD患者的C1qhi單核細(xì)胞中升高。STAT1磷酸化被證實在BD患者的C1qhi單核細(xì)胞中顯著增加（圖6 C）。IFN-γ處理也可顯著增加HC單核細(xì)胞中C1q基因的表達(dá)（圖6D）并且可以增加C1qhi單核細(xì)胞比例（圖6E、F）。

圖6. IFN-γ水平的增加導(dǎo)致了BD中C1qhi單核細(xì)胞的擴(kuò)增

7、C1qhi單核細(xì)胞將BD患者與健康供體區(qū)分開來，并對治療有反應(yīng)

為了探索C1Q Monos的潛在臨床價值，研究者在他們自己的內(nèi)部隊列（n =19）和三個已發(fā)表的BD患者活躍隊列（GSE17114，n = 29；GSE165254， n = 25；GSE70403， n = 58）中挖掘了C1QMonos高表達(dá)基因的預(yù)測能力。在三個隊列中，C1Q Monos中表達(dá)最多的5個基因顯著解釋了方差，并預(yù)測了曲線下面積大于0.7的BD患者（圖7A）。因此，C1Q Monos可以在不同的隊列中區(qū)分BD患者和HC。研究者又調(diào)查了通過單核細(xì)胞亞型全基因組關(guān)聯(lián)研究確定的BD相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)這些基因在C1Q Monos中具有最高平均表達(dá)水平。此外，C1qhi單核細(xì)胞與紅細(xì)胞沉降率（衡量BD炎癥程度的臨床診斷參數(shù)）呈正相關(guān)（結(jié)果在補充圖，此處未列出），在疾病活動度評分高的BD患者中所占比例更高（圖7B）。總之，這些結(jié)果揭示了C1qhi單核細(xì)胞與疾病的顯著相關(guān)性。

此外，研究者還探討了BD患者的C1qhi單核細(xì)胞是否對藥物治療有反應(yīng)，研究表明：免疫抑制治療顯著降低了同一患者的C1qhi單核細(xì)胞（圖7 C）。他們接下來測試了C1qhi單核細(xì)胞是否對tofacitinib有反應(yīng)，研究表明：tofacitinib治療顯著降低了IFN-γ刺激的C1qhi單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平（圖7D）和蛋白質(zhì)水平（圖7E）。以上結(jié)果為C1qhi單核細(xì)胞在監(jiān)測治療效果方面的潛力提供了見解，并表明靶向C1qhi單核細(xì)胞可能是BD治療的有效策略。

圖7. C1qhi單核細(xì)胞區(qū)分了BD患者和HCs，并對BD治療有反應(yīng)

主要結(jié)論

研究者對BD患者和HCs的PBMCs進(jìn)行了單細(xì)胞測序和Bulk RNA測序，測序數(shù)據(jù)整合發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞變化顯著。隨后，研究者對BD患者和HC的PBMCs進(jìn)行磁珠分選單核細(xì)胞并進(jìn)行了單細(xì)胞測序，發(fā)現(xiàn)BD患者中C1qhi單核細(xì)胞明顯增多。并且發(fā)現(xiàn)C1Q單核細(xì)胞具有促炎特性，且BD中C1qhi單核細(xì)胞的擴(kuò)增是由于IFN-γ水平的增加。在tofacitinib治療BD患者之后，C1qhi單核細(xì)胞會減少。此研究確定了C1qhi單核細(xì)胞在BD中的促炎作用，這些數(shù)據(jù)揭示了BD靶向治療和臨床評估的潛在靶點。