基于白介素6的微流控電化學(xué)磁免疫傳感器

近日，英國(guó)期刊Talanta在線刊登香港科技大學(xué)電子與計(jì)算機(jī)工程系Chiye Zhang研究團(tuán)隊(duì)的研究成果“Microfluidic electrochemical magnetoimmunosensor for ultrasensitive detection of interleukin-6 based on hybrid of AuNPs and graphene”，詳細(xì)報(bào)道了用于檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）潛在生物標(biāo)志物——白介素6（interleukin-6，IL-6）的微流控電化學(xué)磁免疫傳感器。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種病因未明的慢性、以炎性滑膜炎為主的系統(tǒng)性疾病，致殘率高、預(yù)后差，目前RA的治療仍然依賴于抑制炎癥。雖然自身免疫性疾病無(wú)法治愈，但早期診斷和定期治療可以顯著減輕癥狀。

研究表明，多種細(xì)胞因子和蛋白酶參與RA的發(fā)病機(jī)制，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素6（IL-6）。這些細(xì)胞因子之間的協(xié)同作用在代謝誘導(dǎo)中至關(guān)重要。IL-6是一種由多種細(xì)胞（包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞）合成的多效性炎癥因子。在RA患者血清中，除TNF-α和IL-1β外，還有大量IL-6，據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，IL-6的表達(dá)水平與RA疾病活動(dòng)指標(biāo)呈正相關(guān)。

因此，開(kāi)發(fā)一種靈敏、快速、定量檢測(cè)IL-6的診斷工具，對(duì)于RA的早期檢測(cè)顯得至關(guān)重要。在該項(xiàng)研究中，研究人員將電化學(xué)傳感器、微流控和磁顆粒三者結(jié)合起來(lái)，開(kāi)發(fā)了一種基于石墨烯和金納米顆粒的新型集成微流控電化學(xué)磁免疫傳感器，用于定量血清樣本中的IL-6。

微流控電化學(xué)磁免疫傳感器的原理

微流控電化學(xué)磁免疫傳感器是通過(guò)集成微型金電極和微流控腔室，通過(guò)電化學(xué)方法在微型金電極表面修飾石墨烯和金納米顆粒，促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移，如圖1所示。

圖1 微流控電化學(xué)磁免疫傳感器的檢測(cè)原理圖。

首先，在微流控腔室外構(gòu)建好磁珠免疫夾心復(fù)合物。在待測(cè)物（IL-6）、生物素化檢測(cè)抗體存在的情況下，由于捕獲抗體磁珠、待測(cè)物及生物素化檢測(cè)抗體之間的特異性識(shí)別，從而在磁珠上形成免疫夾心復(fù)合物。再添加HRP-鏈霉親和素溶液，由于鏈霉親和素和生物素之間的特殊親和力，HRP與免疫夾心結(jié)構(gòu)結(jié)合。

其次，磁鐵捕捉磁珠免疫夾心復(fù)合物。將制備好的磁珠免疫夾心復(fù)合物溶液注入微流控腔室中，在微型電極的正下方放置磁鐵，得以捕捉免疫磁珠。

最后，加入底物溶液，開(kāi)始電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)。向微流控腔室中注入TMB/H?O?底物溶液，由于HRP在H?O?存在下的催化作用，TMB被氧化為TMB（Ox）。酶反應(yīng)產(chǎn)物TMB（Ox）具有電活性，因此可以進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。待測(cè)物IL-6的濃度在一定時(shí)間內(nèi)與TMBox呈正相關(guān)。通過(guò)測(cè)量TMB（Ox）的還原電流，可以間接獲得IL-6的濃度。

構(gòu)建ELISA磁珠免疫夾心結(jié)構(gòu)

研究人員在96孔板中構(gòu)建了ELISA磁珠免疫夾心結(jié)構(gòu)，具體步驟如下：

1）將50ul捕獲抗體磁珠與40ul不同濃度的IL-6混合，4℃孵育過(guò)夜，并持續(xù)振蕩；

2）孵育后，在96孔板的底部放置磁鐵，捕捉IL-6結(jié)合的捕獲抗體磁珠；然后使用0.1% PBST洗滌三次，將未與磁珠結(jié)合的IL-6洗掉；

3）加入100ul生物素化的檢測(cè)抗體，37℃孵育1小時(shí)，在磁珠上形成免疫夾心結(jié)構(gòu)；

4）0.1% PBST洗滌三次后，加入100ul HRP-鏈霉親和素復(fù)合物，37℃孵育30分鐘；

5）0.1% PBST洗滌五次后，加入40ul PBS重懸磁珠免疫夾心復(fù)合物，保存在4℃中備用。

圖2 磁珠上構(gòu)建免疫夾心結(jié)構(gòu)。

微流控電化學(xué)磁免疫傳感器性能測(cè)試

將上述備用的ELISA磁珠免疫夾心結(jié)構(gòu)溶液注入微流控反應(yīng)室中，并應(yīng)用磁鐵捕捉電極表面的磁珠。隨后，將基質(zhì)混合物TMB/H?O?轉(zhuǎn)移到微流控反應(yīng)室中并孵育15分鐘，采用I-T法（0.8V，50s）檢測(cè)待測(cè)物濃度，線性范圍為0.97至250pg/mL，檢測(cè)限（LOD）為0.412pg/mL。測(cè)試結(jié)果如下圖所示。

圖3 （A）不同濃度IL-6的電流響應(yīng)；（B）電化學(xué)磁免疫傳感器對(duì)IL-6的校準(zhǔn)圖，插圖為電流與IL-6濃度對(duì)數(shù)之間的線性關(guān)系。

人血清樣本的電化學(xué)測(cè)量

為了研究微流控磁免疫傳感器在實(shí)際臨床應(yīng)用中的可行性和有效性，研究人員對(duì)加入不同濃度IL-6的人血清樣本進(jìn)行了測(cè)試。如下表所示，回收率在93.37%到103.84%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。這一結(jié)果表明，該研究中的微流控電化學(xué)磁免疫傳感器具有較好的可靠性和精度。