μFCP技術(shù)在控制細胞球大小方面的優(yōu)越性

多細胞肝球作為一種3D培養(yǎng)模型，可用于肝纖維化治療的研究，雖然這些模型可以再現(xiàn)纖維化疾病，然而目前通過隨機分配方法制造的細胞球不易控制，在大小、功能和效用上存在著差異。近日，來自美國加利福尼亞大學的Adam R Abate團隊在Biofabrication上發(fā)表題為“Controlled fabrication of functional liver spheroids with microfluidic flow cytometric printing”的研究新成果。研究人員利用微流控流式細胞打?。é蘁CP）技術(shù)，可實現(xiàn)單細胞打印，得到具有確定數(shù)量的不同細胞類型的肝球。該技術(shù)制造的細胞球在結(jié)構(gòu)與功能上的均勻性均優(yōu)于隨機分配方法生成的細胞球。此外，該技術(shù)每小時產(chǎn)生數(shù)千個細胞球，可批量制造單細胞精度的球狀體，為疾病建模和高通量藥物測試提供可擴展平臺。

μFCP技術(shù)工作原理

細胞識別及分揀是實現(xiàn)精確分配細胞的關(guān)鍵。與傳統(tǒng)的FACS工作原理一樣，μFCP技術(shù)通過熒光和散射特性鑒定出目標細胞，并從流體中分揀出來。不同之處是，該技術(shù)提出了介電泳液滴偏轉(zhuǎn)裝置，利用導電液滴和周圍絕緣空氣之間的介電常數(shù)差異，實現(xiàn)目標細胞的分揀。該裝置體積小至毫米，因此允許靠近接收板，從而提高打印精度。當載有目標細胞如肝細胞（HepG2）或肝星狀細胞（HSC）的液滴流過分揀區(qū)域時，液滴將按需沉積在所需孔內(nèi)，最終形成功能性肝球（如圖1）。

圖1 μFCP技術(shù)制造功能性肝球示意圖

μFCP技術(shù)制造的細胞球具有更好的細胞存活率

當用懸浮細胞組成細胞球時，并非所有的細胞都是活的，隨機分配法會將死亡的細胞也包含在在細胞球中，導致細胞球的特征發(fā)生改變。相比之下，μFCP技術(shù)可以使用活性染料辨別出死細胞并將其排除，從而提高細胞球活性。為了驗證這一點，研究人員將Calcein AM染色后的細胞分別通過隨機分配法和μFCP技術(shù)打印在基底上（如圖2），結(jié)果表明μFCP技術(shù)獲得的細胞群體具有更高的平均熒光，且暗淡的細胞較少。進一步對細胞群體進行EthD-1染色，也同樣觀察到μFCP技術(shù)下的死細胞更少。

圖2 μFCP技術(shù)可分揀活細胞，以提高細胞球活性

μFCP技術(shù)制造的細胞球大小和細胞組分精準可控

細胞球的大小取決于培養(yǎng)時間和初始細胞數(shù)量。為了說明μFCP技術(shù)在控制細胞球大小方面的優(yōu)越性，研究人員使用μFCP和隨機分配兩種技術(shù)打印了不同初始細胞數(shù)量。與隨機分配方法相比，μFCP技術(shù)打印的細胞球尺寸分布更集中（圖3a）。為了展現(xiàn)μFCP技術(shù)具有精準控制細胞球成分的能力，研究人員使用這兩種方法構(gòu)建了目標成分為10個HepG2和10個HSC的細胞球，μFCP制造的細胞球細胞數(shù)量的標準誤差明顯小于隨機分配（圖3b），并且在培養(yǎng)六天后的尺寸變化比隨機分配所產(chǎn)生的細胞球小三倍（圖3c）。

圖3 μFCP技術(shù)允許打印的細胞數(shù)目可控，以獲得更均勻的肝細胞球

μFCP技術(shù)制造的肝細胞球功能可控

纖維化取決于肝細胞和肝星狀細胞之間的相互作用。因此，這些細胞比例的變化可能導致不一致的細胞球功能。為了研究細胞比例對肝球表型和纖維化的影響，研究人員打印了不同比例的HepG2和HSC細胞球，每個細胞球共有100個細胞。培養(yǎng)6天后，細胞球大小隨著HSC數(shù)量的增加而減小（圖4a、b），且球體形態(tài)趨于球形（圖4c）。但當HSC增加超過60%會導致球體形態(tài)不規(guī)則。為了更深入地研究這一點，研究人員量化了I型膠原蛋白的生成，當HSC占比低于50%時，I型膠原蛋白總量隨HSC數(shù)量線性增加，反之下降（圖4e、f），這表明當HepG2過少時，HSC不再分泌膠原蛋白。

圖4 μFCP技術(shù)允許系統(tǒng)化研究細胞類型的比例和數(shù)量對肝球的影響

μFCP技術(shù)制造的細胞球可以實現(xiàn)更精確的藥物篩選

使用細胞球進行藥物篩選時，其大小和功能均勻性直接影響準確性。由于μFCP允許制造具有優(yōu)異均勻性的細胞球，因此與隨機分配方法相比，它能夠?qū)崿F(xiàn)更精確的篩選。為了評估藥物反應的可變性，研究人員通過打印或隨機分配的方式，用60個HepG2和40個HSC細胞制作了細胞球（圖5a）。然后使用TGF-β1促纖維化化合物處理細胞球，這是一種對HSC活化的有效刺激，可產(chǎn)生I型膠原（圖5b、c）。為了比較功能均勻性，研究人員通過計算I型膠原面積來量化I型膠原的數(shù)量（圖5d），發(fā)現(xiàn)TGF-β1顯著增加μFCP打印細胞球和隨機生成細胞球中的I型膠原，與隨機分配的細胞球相比，打印細胞球的測量可變性降低，大大增加了藥物影響的統(tǒng)計顯著性。

圖5 μFCP技術(shù)制造的細胞球用于體外藥物精準測試

目前基于隨機分配制造的肝細胞細胞球存在尺寸和功能可變的問題，這限制了它們再現(xiàn)肝臟生物學和纖維化的重復性，以及作為篩選模型的準確性。研究人員采用的微流控流式細胞打印技術(shù)克服了這些問題，確保了細胞球由所需細胞類型的確切數(shù)量組成。此外，若將該技術(shù)與多路復用光學檢測相結(jié)合，可進一步增加細胞球的復雜度，這將有利于細胞球功能的精準控制。