多細胞肝球作為一種3D培養(yǎng)模型,可用于肝纖維化治療的研究,雖然這些模型可以再現(xiàn)纖維化疾病,然而目前通過隨機分配方法制造的細胞球不易控制,在大小、功能和效用上存在著差異。近日,來自美國加利福尼亞大學的Adam R Abate團隊在Biofabrication上發(fā)表題為“Controlled fabrication of functional liver spheroids with microfluidic flow cytometric printing”的研究新成果。研究人員利用微流控流式細胞打?。é蘁CP)技術(shù),可實現(xiàn)單細胞打印,得到具有確定數(shù)量的不同細胞類型的肝球。該技術(shù)制造的細胞球在結(jié)構(gòu)與功能上的均勻性均優(yōu)于隨機分配方法生成的細胞球。此外,該技術(shù)每小時產(chǎn)生數(shù)千個細胞球,可批量制造單細胞精度的球狀體,為疾病建模和高通量藥物測試提供可擴展平臺。
μFCP技術(shù)工作原理
細胞識別及分揀是實現(xiàn)精確分配細胞的關(guān)鍵。與傳統(tǒng)的FACS工作原理一樣,μFCP技術(shù)通過熒光和散射特性鑒定出目標細胞,并從流體中分揀出來。不同之處是,該技術(shù)提出了介電泳液滴偏轉(zhuǎn)裝置,利用導電液滴和周圍絕緣空氣之間的介電常數(shù)差異,實現(xiàn)目標細胞的分揀。該裝置體積小至毫米,因此允許靠近接收板,從而提高打印精度。當載有目標細胞如肝細胞(HepG2)或肝星狀細胞(HSC)的液滴流過分揀區(qū)域時,液滴將按需沉積在所需孔內(nèi),最終形成功能性肝球(如圖1)。
圖1 μFCP技術(shù)制造功能性肝球示意圖
μFCP技術(shù)制造的細胞球具有更好的細胞存活率
當用懸浮細胞組成細胞球時,并非所有的細胞都是活的,隨機分配法會將死亡的細胞也包含在在細胞球中,導致細胞球的特征發(fā)生改變。相比之下,μFCP技術(shù)可以使用活性染料辨別出死細胞并將其排除,從而提高細胞球活性。為了驗證這一點,研究人員將Calcein AM染色后的細胞分別通過隨機分配法和μFCP技術(shù)打印在基底上(如圖2),結(jié)果表明μFCP技術(shù)獲得的細胞群體具有更高的平均熒光,且暗淡的細胞較少。進一步對細胞群體進行EthD-1染色,也同樣觀察到μFCP技術(shù)下的死細胞更少。
圖2 μFCP技術(shù)可分揀活細胞,以提高細胞球活性
μFCP技術(shù)制造的細胞球大小和細胞組分精準可控
細胞球的大小取決于培養(yǎng)時間和初始細胞數(shù)量。為了說明μFCP技術(shù)在控制細胞球大小方面的優(yōu)越性,研究人員使用μFCP和隨機分配兩種技術(shù)打印了不同初始細胞數(shù)量。與隨機分配方法相比,μFCP技術(shù)打印的細胞球尺寸分布更集中(圖3a)。為了展現(xiàn)μFCP技術(shù)具有精準控制細胞球成分的能力,研究人員使用這兩種方法構(gòu)建了目標成分為10個HepG2和10個HSC的細胞球,μFCP制造的細胞球細胞數(shù)量的標準誤差明顯小于隨機分配(圖3b),并且在培養(yǎng)六天后的尺寸變化比隨機分配所產(chǎn)生的細胞球小三倍(圖3c)。
圖3 μFCP技術(shù)允許打印的細胞數(shù)目可控,以獲得更均勻的肝細胞球
μFCP技術(shù)制造的肝細胞球功能可控
纖維化取決于肝細胞和肝星狀細胞之間的相互作用。因此,這些細胞比例的變化可能導致不一致的細胞球功能。為了研究細胞比例對肝球表型和纖維化的影響,研究人員打印了不同比例的HepG2和HSC細胞球,每個細胞球共有100個細胞。培養(yǎng)6天后,細胞球大小隨著HSC數(shù)量的增加而減小(圖4a、b),且球體形態(tài)趨于球形(圖4c)。但當HSC增加超過60%會導致球體形態(tài)不規(guī)則。為了更深入地研究這一點,研究人員量化了I型膠原蛋白的生成,當HSC占比低于50%時,I型膠原蛋白總量隨HSC數(shù)量線性增加,反之下降(圖4e、f),這表明當HepG2過少時,HSC不再分泌膠原蛋白。
圖4 μFCP技術(shù)允許系統(tǒng)化研究細胞類型的比例和數(shù)量對肝球的影響
μFCP技術(shù)制造的細胞球可以實現(xiàn)更精確的藥物篩選
使用細胞球進行藥物篩選時,其大小和功能均勻性直接影響準確性。由于μFCP允許制造具有優(yōu)異均勻性的細胞球,因此與隨機分配方法相比,它能夠?qū)崿F(xiàn)更精確的篩選。為了評估藥物反應的可變性,研究人員通過打印或隨機分配的方式,用60個HepG2和40個HSC細胞制作了細胞球(圖5a)。然后使用TGF-β1促纖維化化合物處理細胞球,這是一種對HSC活化的有效刺激,可產(chǎn)生I型膠原(圖5b、c)。為了比較功能均勻性,研究人員通過計算I型膠原面積來量化I型膠原的數(shù)量(圖5d),發(fā)現(xiàn)TGF-β1顯著增加μFCP打印細胞球和隨機生成細胞球中的I型膠原,與隨機分配的細胞球相比,打印細胞球的測量可變性降低,大大增加了藥物影響的統(tǒng)計顯著性。
圖5 μFCP技術(shù)制造的細胞球用于體外藥物精準測試
目前基于隨機分配制造的肝細胞細胞球存在尺寸和功能可變的問題,這限制了它們再現(xiàn)肝臟生物學和纖維化的重復性,以及作為篩選模型的準確性。研究人員采用的微流控流式細胞打印技術(shù)克服了這些問題,確保了細胞球由所需細胞類型的確切數(shù)量組成。此外,若將該技術(shù)與多路復用光學檢測相結(jié)合,可進一步增加細胞球的復雜度,這將有利于細胞球功能的精準控制。
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原文標題:利用微流控流式細胞打印技術(shù),實現(xiàn)功能性肝球的可控制造
文章出處:【微信號:Micro-Fluidics,微信公眾號:微流控】歡迎添加關(guān)注!文章轉(zhuǎn)載請注明出處。
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