全光纖傳輸光度測量系統(tǒng)獨特的功能

與傳統(tǒng)的大腦成像技術(shù)相比，光纖光度法越來越受歡迎，它可以更好地掌握大腦的內(nèi)部運作。隨著方法的不斷改進(jìn)，這是一個新技術(shù)的開始。

圖 1. 多通道光纖光度測量系統(tǒng)（photometry system）的構(gòu)建。488nm 激光器的光束通過物鏡同時耦合到一系列多模光纖中。然后發(fā)射的熒光由同一組光纖收集并由 sCMOS 相機(jī) (a) 檢測。雙通道模式 (b) 和四通道模式 (c) 的 sCMOS 相機(jī)上的光纖端面。

對大腦復(fù)雜性的全面、完整的理解仍然難以捉摸。揭開它的奧秘是了解神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵——從阿爾茨海默氏癥（Alzheimer’s）和癡呆癥（dementia）到癲癇（epilepsy）和多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis）——以及更有效地治療甚至治愈它們的能力。

長期依賴的非侵入性成像技術(shù)（non-invasive imagingtechniques），如 MRI 和 CT 掃描提供了對大腦內(nèi)部的觀察條件，但使用光纖的方法顯示出更為良好的效果，尤其是光纖光度法（fiber photometry）。

光纖光度法是一種用于研究神經(jīng)回路的光學(xué)成像技術(shù)，最初由慕尼黑路德維希馬克西米利安大學(xué)（Ludwig Maximilian Universityof Munich）的一個團(tuán)隊于 2005 年開發(fā)，用于記錄新生小鼠靜息時的皮質(zhì)（大腦外層the outer layer of the cerebrum）鈣離子波(Ca2+) 。它涉及將光纖植入大腦，以觀察和記錄大腦不同區(qū)域內(nèi)特定類型細(xì)胞的神經(jīng)元群體水平（population-level）的 Ca2+ 活動。在大腦中，鈣活動是控制突觸運動和記憶形成等活動的核心。

與基因編碼（genetically encoded）的鈣指示劑（calcium indicators）結(jié)合使用，纖維光度法可以實時監(jiān)測神經(jīng)活動。

“纖維光度法提供了一種獨特的功能，可以輕松穩(wěn)定地記錄自由活動動物中具有細(xì)胞類型特異性的種群活動，” 華中科技大學(xué)的Ruonan Fan 博士說。她在華中武漢光電子國家實驗室助理主任、布里頓機(jī)會生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)中心首席研究員傅玲領(lǐng)導(dǎo)的實驗室工作。

不斷增長的優(yōu)勢

雖然低時間和空間分辨率是一個顯著的挑戰(zhàn)，但光度法仍然是優(yōu)于其他鈣成像技術(shù)（如單光子或雙光子顯微鏡）的首選方法。光纖更容易植入，重量也更輕，允許受試者自由移動和執(zhí)行自然行為，這也是該技術(shù)的關(guān)鍵。光纖光度法也更能抵抗電磁干擾，更有效地收集數(shù)據(jù)，并且迄今為止已被證明對于長期神經(jīng)監(jiān)測更穩(wěn)定。

“它已成為神經(jīng)科學(xué)中一種廣泛使用的光學(xué)方法，”范博士提到，并引用了 Fu 教授團(tuán)隊在 2015 年開發(fā)的可擴(kuò)展多通道光纖光度測量系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以同時監(jiān)測動物甚至不同動物的多個大腦區(qū)域的神經(jīng)活動。

Fu 實驗室領(lǐng)導(dǎo)的另一項研究涉及在 2019 年開發(fā)特定于軸突末端的多通道光纖光度計。研究小組在研究中解釋說，軸突主要通過其末端的突觸將信息從一個神經(jīng)元傳輸?shù)搅硪粋€神經(jīng)元，并且“從自由移動動物的軸突末端記錄是了解動物行為過程中信息處理的重要步驟。”

現(xiàn)在，由 Fu 團(tuán)隊領(lǐng)導(dǎo)的正在進(jìn)行的研究（今年 5 月首次發(fā)表）在傳統(tǒng)技術(shù)的基礎(chǔ)上提供了更多優(yōu)勢。

“我們開發(fā)了一種兼容且靈活的全光纖傳輸光度測量系統(tǒng)，”范說?！拔覀兛梢酝瑫r實現(xiàn)光遺傳學(xué)操作和神經(jīng)元活動的多色記錄以及自由移動（neuronal activities）動物的神經(jīng)遞質(zhì)釋放（neurotransmitter release）?！?/p>

該團(tuán)隊一直在研究在動物行為期間以細(xì)胞類型特異性和精確的時空分辨率來操縱和實時監(jiān)測神經(jīng)元活動?！斑@些是探索體內(nèi)神經(jīng)回路的功能連接、信息傳遞和生理功能的基礎(chǔ)技術(shù)，”范說。

新的全光纖傳輸光度測量系統(tǒng)基于多分支光纖束（圖 1）。它允許在自由移動的動物中同時進(jìn)行光遺傳學(xué)操作和多色記錄神經(jīng)元 Ca2+（或神經(jīng)遞質(zhì)信號）。

“這是對當(dāng)前光纖光度測量系統(tǒng)的有效補(bǔ)充，”范說。

新系統(tǒng)實現(xiàn)了對可見光譜（visible spectrum）的全覆蓋，用于多色激發(fā)和光遺傳學(xué)（optogenetic）操作，以及激發(fā)和發(fā)射光的全光纖傳輸。范說，這是通過結(jié)合非波長選擇性四分支纖維束專門完成的，該纖維束可以實現(xiàn)多色記錄（multicolor recording），同時還支持精確的光遺傳學(xué)刺激（圖 2）。該束與光電倍增管 (PMT) 相結(jié)合，以取代傳統(tǒng)的成像結(jié)構(gòu)。還使用了定制設(shè)計的鎖定放大器，以準(zhǔn)確分離 PMT 檢測到的具有不同波長的兩個熒光信號，并有效抑制光遺傳學(xué)刺激引起的偽影（artifacts）和通道串?dāng)_(channel crosstalk)。

圖 2. 定制設(shè)計的四分支光纖束和多功能光纖光度測量系統(tǒng)。四分支纖維束（a）包括單纖維分支（i~iii）、集合分支（iv）和公共分支（v）。四分支光纖束 (b) 普通分支 (v) 示意圖。公共分支 v (500 μm) 總共由 85 根六邊形分布式光纖 (Φ50 μm/0.54 NA) 組成。束中心的三個較亮的光纖對應(yīng)于三個單光纖分支 (i~iii)，用于耦合到三個不同的激發(fā)光。四分支光纖束構(gòu)建的多功能光纖測光系統(tǒng)示意圖。將三個不同波長的光源耦合到多模光纖中，并通過三個單纖分支 i~iii (c) 連接到鼠標(biāo)。多功能光纖測光系統(tǒng)的鎖定放大器示意圖（d）。這兩種激發(fā)光由具有不同頻率（450 nm，211 Hz；561 nm，531 Hz）的正弦信號調(diào)制。

“我們進(jìn)行了一系列實驗，表明該系統(tǒng)具有出色的透光性能。它能夠有效地激發(fā)和收集熒光信號，收集效率比傳統(tǒng)系統(tǒng)提高 20% 到 30%?！狈墩f。

研究小組沒有發(fā)現(xiàn)實質(zhì)性的通道串?dāng)_，并成功記錄了伏隔核 (NAc) 中的神經(jīng)元 Ca2+ 和神經(jīng)遞質(zhì)動態(tài)信號——一種主要由中等多刺神經(jīng)元組成的結(jié)構(gòu)，其特點是多巴胺受體（dopamine receptors）的相對表達(dá)——同時在自由移動的小鼠身上對同一部位的多巴胺能末端進(jìn)行精確的光遺傳學(xué)操作。研究人員還能夠在記錄時將刺激偽影（由于它們是非生理性的而導(dǎo)致噪聲干擾的短時間、高振幅的神經(jīng)尖峰）抑制到基礎(chǔ)噪聲水平（basal noise level）（圖 3）。

圖 3. 自由移動小鼠 NAcLat（伏隔核外側(cè)殼）中神經(jīng)元活動的同時雙色記錄和光遺傳學(xué)操作。 (a) 神經(jīng)元活動手術(shù)同步雙色記錄和光遺傳學(xué)操作示意圖。 (b) 組織學(xué)證實 NAcLat 中 GFP (綠色) 標(biāo)記的神經(jīng)元和 ChrimsonR (紅色) 標(biāo)記的多巴胺能神經(jīng)元末端表達(dá)。腦切片在前囟前 1.1 毫米處。 (c) 在該系統(tǒng)中同時進(jìn)行光遺傳學(xué)操作和實時雙色記錄時不存在刺激偽影。紅色條表示刺激時間。 (d) 在自由移動的小鼠的 NAcLat 中同時記錄的 DA 和神經(jīng)元 Ca2+ 痕跡的示例。 (e) 響應(yīng)階段性光遺傳學(xué)刺激的平均 DA 信號和神經(jīng)元 Ca2+ 信號瞬變（10 次試驗）。紅色條表示刺激時間。橙色段表示從基線統(tǒng)計顯著增加。 (f) 響應(yīng)強(qiáng)直光遺傳學(xué)的平均 DA 信號和神經(jīng)元 Ca2+ 信號瞬變。紅色條表示刺激時間。

“隨著它的進(jìn)步，纖維光度法在神經(jīng)科學(xué)家中越來越受歡迎，作為記錄基因定義的神經(jīng)元群體的便捷工具，”范說?！岸罄m(xù)的改進(jìn)主要集中在不同的應(yīng)用需求上?！?/p>

早期用于光遺傳學(xué)操縱或記錄神經(jīng)元活動的光纖測光技術(shù)和系統(tǒng)通常是分開的并獨立工作，它們只能在單個波長下進(jìn)行操縱和單通道記錄。另一個挑戰(zhàn)是，由于光敏蛋白（spectrum of photosensitiveproteins）的激發(fā)光譜與基因編碼的鈣指示劑的發(fā)射光譜之間的重疊，在多色記錄和操作過程中會出現(xiàn)刺激偽影（stimulation artifacts）。

“為了同時實現(xiàn)光遺傳學(xué)操作和雙色記錄，需要涉及更多具有光譜間距的波長范圍熒光蛋白，”范說?！耙虼耍鈱W(xué)系統(tǒng)需要完全覆蓋可見光譜?！?/p>

但范補(bǔ)充說，這是目前可用的光纖光度測量系統(tǒng)的一個問題，因為它們使用經(jīng)典的落射熒光成像架構(gòu)（classical epifluorescenceimaging architecture）僅覆蓋 405 到 600 nm 左右的光譜，該架構(gòu)由一個物鏡和兩個或三個二向色鏡組成。 “在這種情況下，”她說，“需要更多的分色鏡將多波長光束耦合到一根光纖中，這使得系統(tǒng)擴(kuò)展光譜更加復(fù)雜?！?/p>

新的全光纖傳輸光度測量系統(tǒng)可用于“進(jìn)一步觀察不同類型神經(jīng)元的活動，同時進(jìn)行光遺傳學(xué)操作和多色記錄，以監(jiān)測光遺傳學(xué)干預(yù)神經(jīng)回路引起的反饋效應(yīng)，”范說。 “這現(xiàn)在被認(rèn)為是神經(jīng)回路和神經(jīng)系統(tǒng)疾病因果研究的‘夢想方法’?！?/p>