基于數(shù)字微流控技術的上呼吸道易感病毒多靶標快速檢測方法

呼吸道病毒感染由于其高致病率及致死率，成為世界各國人民發(fā)病和死亡的主要原因之一。引起上呼吸道感染的病毒種類較多，尤其是甲型流感病毒新型H5N1（FluA-H5N1）、甲型流感病毒新型H1N1（FluA-H1N1）、乙型流感病毒（FluB）、冠狀病毒（SARS-CoV）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）、新型冠狀病毒（2019-nCOV）等病毒在近一個世紀以來的多次大規(guī)模流行，給人類的生命健康和社會經(jīng)濟帶來巨大傷害。

這些上呼吸道感染的病毒引起的感染癥狀和季節(jié)性流行病毒特點相似，為避免造成群聚傳染，快速鑒別呼吸道病原體的檢測顯得尤為重要。

據(jù)麥姆斯咨詢報道，近期，拱北海關技術中心等科研機構于《熱帶醫(yī)學雜志》發(fā)表研究性論文，將RT-qPCR技術和數(shù)字微流控技術相結合，建立一種基于數(shù)字微流控RT-qPCR芯片技術的上呼吸道易感病毒多靶標快速檢測方法。實現(xiàn)一種以少量樣品同時快速檢測多個呼吸道病原體的檢測技術。該方法滿足了目前市場對呼吸道病原體的高診斷率的需求，同時還為精準醫(yī)療提供了新的檢驗手段。

為實現(xiàn)一個芯片多個項目的檢測功能，研究人員將6個引物（2019-nCOV-N引物、2019-nCOV-Orf1引物、FluA-M1引物、FluB-HA引物、SARS-65引物、MERS-62引物）和相應探針分別預存到芯片的各個反應點中，并向反應點添加引物預存液，而后將芯片置于風干干燥箱中干燥，接著將干燥好的芯片取出進行封裝處理。

芯片設置6個反應點，從左往右依次是預存的2019-nCOV-N引物、2019-nCOV-Orf1引物、FluA-M1引物、FluB-HA引物、SARS-65引物和MERS-62引物

為了驗證該數(shù)字微流控RT-qPCR芯片的檢測性能，研究人員使用TE緩沖液將陽性質粒10倍稀釋為10 pg/μL至0.01 fg/μL的濃度梯度，并根據(jù)RT-qPCR反應體系和反應程序，完成各單項目的引物、探針在AGS4800實時熒光定量PCR儀上的檢測下限檢測。

同樣，對相應濃度的質粒使用數(shù)字微流控芯片完成實時熒光RT-qPCR反應。如圖2所示，6種引物在AGS4800實時熒光定量PCR儀上均可檢出對應的陽性質粒，對于10 pg/μL的質粒均可在20個循環(huán)之前檢出，且45個循環(huán)內無非特異性擴增。

圖2 檢測試劑測試結果

此外，F(xiàn)luA、FluB、SARS-CoV、MERS-CoV、2019-nCOV這5個檢測項目使用PCR儀的25 μL體系最低可檢出0.01 fg/μL的質粒，而數(shù)字微流控RT-qPCR芯片法每個反應最低可檢出0.1 fg/μL的質粒，與PCR儀2 μL體系靈敏度相同。根據(jù)公式，質?？截悢?shù)濃度 =（質粒濃度×摩爾系數(shù)）/（質粒長度×堿基對平均分子量），分別計算2種方法中的每個反應的質?？截悢?shù)可得知，上述2種方法在2~25μL的體系下檢出限均為12~15拷貝/反應，檢測下限基本一致（圖3）。

圖3 數(shù)字微流控RT-qPCR芯片的檢測下限測試結果

最后，為明確該數(shù)字微流控RT-qPCR芯片的檢測靈敏度和特異性，研究人員同時使用數(shù)字微流控RT-qPCR芯片和RT-qPCR儀檢測20個臨床標本（包含新冠病毒2例，甲型流感8例，乙型流感6例）的5項呼吸道病毒項目，共計100個測試反應，見表1。

結果顯示微流控芯片除樣品7出現(xiàn)一次對甲型流感病毒漏檢外，其余陽性樣品均檢出對應病毒，對于20個樣品的5種病毒的總靈敏度為94%，總特異性為100%。Kappa值 = 0.962，兩個檢測方法具有高度一致，并且差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

表1 PCR儀和微流控芯片檢測臨床樣本結果匯總

綜上所述，該研究將多個RT-qPCR檢測項目與數(shù)字微流控檢測芯片結合，建立了在一次反應中同時檢測多個項目的數(shù)字微流控RT-qPCR芯片。該數(shù)字微流控芯片RT-qPCR法可以以最少的樣本量快速檢測多個項目，自動化程度更高，可以提高上呼吸道病毒檢測的效率，提高應對大規(guī)模疫情的快速反應能力。

審核編輯：劉清