用于活病原體快速檢測(cè)的微流控系統(tǒng)研究進(jìn)展

快速、敏感和選擇性地檢測(cè)活病原體仍然是質(zhì)量控制和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的關(guān)鍵優(yōu)先事項(xiàng)。而傳統(tǒng)方法往往需要復(fù)雜的工作流程、昂貴的試劑、實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，并且耗時(shí)，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和在低資源環(huán)境的應(yīng)用。開發(fā)低成本和快速的替代方法來檢測(cè)不同環(huán)境基質(zhì)中的活病原體已引起越來越多的關(guān)注。其中，以小型化方式集成各種實(shí)驗(yàn)室功能的微流控系統(tǒng)已被證明是一種有前途的病原體快速敏感檢測(cè)工具。

基于此，英國(guó)克蘭菲爾德大學(xué)（Cranfield University）楊竹根教授簡(jiǎn)要總結(jié)了近年來發(fā)展起來的新型微流控系統(tǒng)，并就檢測(cè)時(shí)間、檢測(cè)限和目標(biāo)生物等方面與傳統(tǒng)方法進(jìn)行了比較，討論了專門用于檢測(cè)活病原體的微流控系統(tǒng)的發(fā)展。此外，該論文還展望了微流控系統(tǒng)用于活病原體檢測(cè)的前景，并重點(diǎn)討論了微流控系統(tǒng)在快速、低成本的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面的應(yīng)用潛力。

檢測(cè)活病原體的常規(guī)技術(shù)

盡管存在一些缺陷，例如無法檢測(cè)不可培養(yǎng)的細(xì)菌以及耗時(shí)耗力的檢測(cè)方案，但基于培養(yǎng)的微生物分析由于其高靈敏度、特異性和定量能力，仍然是活病原體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)（圖1）。幾種市售檢測(cè)微生物指標(biāo)（如大腸桿菌）的方法都是基于細(xì)胞培養(yǎng)方法。

該方法依賴于使用特定的生長(zhǎng)培養(yǎng)基來選擇性地培養(yǎng)和分離感興趣的病原體?；罴?xì)胞的檢測(cè)通過在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌落、測(cè)量液體培養(yǎng)物的光密度或直接使用顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)，通常需要數(shù)天甚至數(shù)周才能得出結(jié)果，這取決于病原體形成可見菌落的能力。

此外，雖然陽性培養(yǎng)結(jié)果可以作為活體有機(jī)體的確鑿證據(jù)，但陰性培養(yǎng)結(jié)果不能作為樣本中沒有活細(xì)胞的證據(jù)。因此，檢測(cè)不可培養(yǎng)細(xì)菌（VNCB）活體仍然是最重要的挑戰(zhàn)之一，這可能導(dǎo)致臨床診斷（如藥物敏感性檢測(cè)）中的假陰性結(jié)果和危險(xiǎn)后果。此外，常規(guī)的檢測(cè)技術(shù)不適用于低資源環(huán)境，因?yàn)樗鼈冃枰嘿F的實(shí)驗(yàn)室設(shè)施，而且訓(xùn)練有素的人員可能需要幾天甚至幾周才能得出結(jié)果，這使得它們對(duì)于常規(guī)水質(zhì)監(jiān)測(cè)或快速追蹤疾病暴發(fā)等特定任務(wù)不切實(shí)際。

圖1檢測(cè)活病原體的常規(guī)技術(shù)

用于檢測(cè)活微生物的微流控系統(tǒng)

微流控系統(tǒng)可分為兩大類：微全分析系統(tǒng)（μTAS）和基于紙張的微流控分析系統(tǒng)（μPADs）。它們的制造方法不同，采樣和檢測(cè)組件也不同。μTAS的概念于1990年首次提出，它是在硅片上建立的集樣品預(yù)處理、分離和檢測(cè)于一體的液相色譜儀。μTAS的應(yīng)用方向主要包括細(xì)胞組學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷和環(huán)境監(jiān)測(cè)，也被用于制藥的微反應(yīng)器。μTAS的優(yōu)點(diǎn)包括使用低樣本量和試劑量、降低檢測(cè)成本和檢測(cè)時(shí)間、簡(jiǎn)化操作，以及與傳統(tǒng)檢測(cè)相比可以集成更多功能。

近年來，一些微流控阻抗生物傳感器已被開發(fā)用于檢測(cè)活的全細(xì)菌細(xì)胞。最近，Liu等開發(fā)了一種阻抗生物傳感器，用于檢測(cè)火雞食品樣品中兩種不同血清型的沙門氏菌細(xì)胞。該生物傳感器由一個(gè)玻璃芯片和兩個(gè)檢測(cè)區(qū)域組成，檢測(cè)區(qū)域由含有固定化抗沙門菌抗體的微間隙叉指電極（IDE）陣列構(gòu)成，用于阻抗測(cè)量，以檢測(cè)細(xì)胞的存在/缺失（圖2A）。

該傳感器包含兩個(gè)感應(yīng)IDE陣列，每一個(gè)都有針對(duì)特定沙門氏菌血清型的不同抗體。使用注射泵將樣品通過抗原入口注入，之后放置半小時(shí)，使抗體與沙門氏菌細(xì)胞結(jié)合，然后進(jìn)行后續(xù)洗滌步驟。隨后使用阻抗分析儀測(cè)量阻抗并且將其與樣品注入前獲得的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行比較。這樣，阻抗測(cè)量的差異就對(duì)應(yīng)于樣品中存在的細(xì)胞濃度。

圖2 用于檢測(cè)活微生物的微流控系統(tǒng)

代謝活性與細(xì)胞培養(yǎng)

目前，有許多市售檢測(cè)方法通過比色法、熒光法和生物發(fā)光法檢測(cè)代謝活性或細(xì)胞分裂，以確定樣品中是否存在活病原體。這些方法需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間和復(fù)雜的工作流程。微流控系統(tǒng)可以極大地將檢測(cè)方案小型化和自動(dòng)化，這可能是一種改善活細(xì)胞檢測(cè)的有用方法。

ATP是最常用的細(xì)胞活力生物標(biāo)志物之一，然而，將ATP測(cè)量納入微流控系統(tǒng)的工作很少。Lee等人開發(fā)了一種用于實(shí)時(shí)檢測(cè)氣溶膠中ATP的生物傳感器。將一個(gè)氣溶膠冷凝系統(tǒng)耦合到一個(gè)硅微流控芯片和一個(gè)生物發(fā)光傳感器中，冷凝過程允許氣溶膠樣本快速濃縮和水解，然后插入微流控通道，裂解緩沖液和D-熒光素-熒光素酶試劑通過單獨(dú)的入口被引入。

隨后，通過微流控通道將試劑與細(xì)菌細(xì)胞混合，使游離ATP與D-熒光素-熒光素酶發(fā)生反應(yīng)，并將混合物運(yùn)輸?shù)綑z測(cè)區(qū)域，在檢測(cè)區(qū)域使用電路測(cè)量生物發(fā)光強(qiáng)度（圖3）。

圖3 代謝活性與細(xì)胞培養(yǎng)

總體而言，在活細(xì)胞檢測(cè)方面，利用微流控系統(tǒng)進(jìn)行的研究工作還非常有限，主要集中在阻抗傳感器、ATP檢測(cè)和液滴細(xì)胞培養(yǎng)等。然而，仍有一些不同的技術(shù)，如RNA檢測(cè)、蛋白質(zhì)合成、熱流監(jiān)測(cè)等，其集成到微流控系統(tǒng)的潛力仍有待探索。隨著最近SARS-COV-2的暴發(fā)，全球?yàn)楦纳撇《驹\斷技術(shù)而做出的努力迅速增加。使用基于阻抗的微流控系統(tǒng)根據(jù)病毒包膜的完整性來區(qū)分傳染性和非傳染性病毒顆粒，是一個(gè)需要進(jìn)一步研究的領(lǐng)域，可能在臨床和流行病學(xué)研究中有很大用途。

審核編輯：劉清