用于多維度蛋白質(zhì)溶解度優(yōu)化的超高通量微流控平臺(tái)

多肽、蛋白質(zhì)和抗體等生物制劑是過去十年中增長最快的藥物類別。與小分子相比，它們具有較低的毒性、較高的結(jié)合親和力和特異性，以及較好的藥代動(dòng)力學(xué)。然而，在藥物開發(fā)過程中，許多此類化合物可能由于早期階段就存在的溶解度差的問題，從而在晚期階段導(dǎo)致代價(jià)高昂的藥物開發(fā)失敗，或者開發(fā)出來的產(chǎn)品在使用時(shí)缺乏便利性。例如，一些開發(fā)出來的生物制劑產(chǎn)品是以凍干形式進(jìn)行儲(chǔ)存，因此需要在給藥前溶解，并通過靜脈而不是皮下進(jìn)行給藥，這可能導(dǎo)致每次給藥都需要去醫(yī)院進(jìn)行長時(shí)間的就診，而無法實(shí)現(xiàn)居家給藥。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，近期，英國劍橋大學(xué)（University of Cambridge）的研究人員提出了一種微流控平臺(tái)，可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)相對(duì)溶解度的測量。該微流控平臺(tái)僅需利用20 μg純化蛋白質(zhì)，即可獲得超過10000個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，并最終實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的低成本、高通量測量。與以往的方法相比，該方法使得可獲取的數(shù)據(jù)點(diǎn)增加了1000倍，同時(shí)所需材料減少了10倍以上。這種超高通量的方法可以在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化多個(gè)變量。因此，該微流控平臺(tái)具有簡化藥物開發(fā)過程的潛力，并可以大大增加研究人員對(duì)生物制劑的溶解度和輔料效果的認(rèn)知。相關(guān)研究成果以“Multidimensional Protein Solubility Optimization with an Ultrahigh-Throughput Microfluidic Platform”為題，發(fā)表于Anal. Chem.期刊。

圖1 在超高通量聚集試驗(yàn)中測量蛋白質(zhì)溶解度的微流控平臺(tái)

研究人員首先利用微流控技術(shù)生成了數(shù)千個(gè)含有蛋白質(zhì)、輔料和沉淀劑的微液滴。通過調(diào)節(jié)含有蛋白質(zhì)、緩沖液、聚乙二醇（PEG）和選定輔料的溶液的流速，可以創(chuàng)建一系列具有不同物質(zhì)成分比例的微液滴。隨后將熒光染料（游離于溶液中作為條形碼或與蛋白質(zhì)結(jié)合）添加到溶液中。將生成的微液滴“孵育”5分鐘后，在與所添加的熒光染料相對(duì)應(yīng)的波長下進(jìn)行成像，即可以從熒光強(qiáng)度推斷出液滴中化合物的濃度。此外，由于蛋白質(zhì)帶有熒光標(biāo)記，研究人員可以通過直接觀察來判斷蛋白質(zhì)是均勻地分布在液滴中，還是形成了沉淀物。如果蛋白質(zhì)形成了沉淀物，液滴中會(huì)顯示出明亮的光譜。

接著，研究人員對(duì)藥物制劑配方中常用的輔料（例如氯化鈉（NaCl）、組氨酸、精氨酸、蔗糖以及聚山梨酯20和80）在增加蛋白質(zhì)溶解度方面的效果進(jìn)行了量化研究。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正如在理想狀態(tài)下所預(yù)期的那樣，在給定的濃度范圍內(nèi)，輔料可以線性提高蛋白質(zhì)的溶解度。通過比較圖2中顯示的白色邊界的斜率，研究人員可以對(duì)這些輔料增加蛋白質(zhì)溶解度的能力進(jìn)行排名。此外，除了比較曲線的斜率，還可以利用曲線下面積（AUC）對(duì)這些輔料進(jìn)行定量地對(duì)比。利用圖2中的測量值，研究人員可以合理地設(shè)計(jì)一種配方來提高所研究的蛋白質(zhì)的溶解度。

圖2 常用輔料的配方優(yōu)化示意圖

此外，使用該微流控平臺(tái)，研究人員還可以在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中以高分辨率研究不同輔料的組合效果，從而在優(yōu)化配方時(shí)節(jié)省額外的時(shí)間和材料。另外，pH值是影響蛋白質(zhì)溶解度的另一個(gè)重要因素，因此，研究人員使用微流控平臺(tái)對(duì)該影響因素進(jìn)行了探索。研究人員分別測量了牛血清白蛋白（BSA）在處于pH = 4、5、6、7、8和9的緩沖環(huán)境的制劑中的溶解度（圖3b）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH = 4時(shí)，BSA的相對(duì)溶解度為9.7% ± 0.3% PEG，在pH = 5時(shí)，BSA的相對(duì)溶解度為6.7% ± 0.4% PEG。因此，如果只考慮溶解度，pH = 4的配方更優(yōu)。此外，增加pH值也可以顯著提高溶解度，當(dāng)pH = 9時(shí)，BSA的溶解度非常高，以至于在該實(shí)驗(yàn)條件下無法確定BSA的溶解度數(shù)值。此外，值得注意的是，與以往的測量方法相比，圖3所示的基于微流控平臺(tái)的測量方法需要的蛋白質(zhì)量減少了90%，“孵育”時(shí)間也從2天顯著減少為5分鐘，并且由于測量過程中可以獲得數(shù)千個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)而不是僅僅幾十個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，采用微流控平臺(tái)的測量方法，其測量誤差更小。

圖3 不同配方輔料組合的對(duì)比和pH值的優(yōu)化

另一種提高蛋白質(zhì)溶解度的方法是使蛋白質(zhì)發(fā)生突變，以獲得更多的可溶性突變體，同時(shí)保持其所需的其它功能。該研究所提出的微流控平臺(tái)可以成功用于測量蛋白質(zhì)突變體的溶解度。圖4a顯示了野生型IgG4抗體和研究人員所設(shè)計(jì)的六個(gè)突變體的結(jié)構(gòu)。研究人員首先利用CamSol方法對(duì)這些突變體的相對(duì)溶解度進(jìn)行了預(yù)測，預(yù)測結(jié)果顯示，突變體1~3比野生型IgG4抗體的溶解度低，而突變體4~6比野生型IgG4抗體的溶解度高（圖4b）。隨后，研究人員利用該微流控平臺(tái)對(duì)突變體和野生型IgG4抗體的溶解度進(jìn)行了測量，測量結(jié)果顯示，突變體1~3確實(shí)具有較低的相對(duì)溶解度，而突變體4~6具有較高的溶解度。值得注意的是，完整的IgG4抗體具有約1350個(gè)殘基，而這些突變體僅存在2~4個(gè)突變點(diǎn)，即使在這樣的情況下，該微流控平臺(tái)也可以有效地選擇出溶解度更高的突變體，從而有效優(yōu)化蛋白質(zhì)序列。

圖4 IgG4抗體和六種突變體的溶解度測量

總體而言，優(yōu)化蛋白質(zhì)的溶解度仍然是開發(fā)基于蛋白質(zhì)的藥物的重大挑戰(zhàn)。然而，現(xiàn)有技術(shù)對(duì)材料的要求很高，并且沒有足夠的通量來測量早期開發(fā)過程中的蛋白質(zhì)溶解度或廣泛優(yōu)化配方。該研究提?出了一個(gè)可以同時(shí)解決這兩個(gè)問題的微流控平臺(tái)。該微流控平臺(tái)可以量化通過加入不同種類和不同濃度的配方輔料所獲得的蛋白質(zhì)溶解度的提升效果，并優(yōu)化pH值以提高蛋白質(zhì)藥物的溶解度。此外，該方法可以對(duì)蛋白質(zhì)突變體進(jìn)行準(zhǔn)確的溶解度排序，即使這些突變體僅存在幾個(gè)突變點(diǎn)。因此，該微流控平臺(tái)提供了一種高度定量的策略，可用于改善影響蛋白質(zhì)溶解度的各個(gè)因素，并有助于開發(fā)新的基于蛋白質(zhì)的藥物。

審核編輯：劉清