利用DNA計(jì)算介導(dǎo)的串聯(lián)微流控平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡亞群的有效分離

細(xì)胞外囊泡（EVs）由不同類型細(xì)胞產(chǎn)生，對細(xì)胞間交流至關(guān)重要。不同細(xì)胞來源的EV亞群可以準(zhǔn)確地與各自對應(yīng)受體細(xì)胞精確相互作用，進(jìn)行內(nèi)化并發(fā)揮功能。因此，分離多個(gè)EVs亞群對于充分解析EVs生物功能具有重要意義。 目前已經(jīng)開發(fā)了多種EVs分離技術(shù)，包括超速離心、尺寸排阻和親和分離等。其中，親和分離通常具有較好選擇性，其原理為主要通過抗體/核酸適體等識(shí)別分子對EVs上單一生物標(biāo)志物的相互作用以實(shí)現(xiàn)EVs分離。然而，盡管在某些應(yīng)用中親和分離行之有效，但由于大多數(shù)EVs亞群缺乏特異性單一生物標(biāo)志物，所以較難實(shí)現(xiàn)它們與密切相關(guān)的EVs混合群體的明確區(qū)分。

基于適體識(shí)別的DNA計(jì)算技術(shù)的快速發(fā)展為EVs分離分析離提供了一種強(qiáng)有力的工具。宋彥齡教授團(tuán)隊(duì)前期已發(fā)展了基于雙適體鄰位連接的特定EV亞群的高靈敏檢測方法（Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 7582），以及基于適體靶向識(shí)別和代謝標(biāo)記的EV特定蛋白糖基化成像方法（Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 18111）。然而，考慮到邏輯計(jì)算設(shè)計(jì)的復(fù)雜性以及EVs的高度異質(zhì)性，現(xiàn)有的方法往往一次只能定量一個(gè)特定的EVs亞群，難以同時(shí)分離多個(gè)EVs亞群。由于分離方法的缺乏，目前難以實(shí)現(xiàn)對多個(gè)EVs亞群同時(shí)分離分析及下游分析，從而阻礙了對EVs亞群生物學(xué)功能和臨床應(yīng)用的深入探索。因此，亟需發(fā)展一種多EVs亞群的分離策略。

近日，廈門大學(xué)宋彥齡教授團(tuán)隊(duì)在國際期刊small methods上發(fā)表了題為“Isolation of PD-L1 Extracellular Vesicle Subpopulations Using DNA Computation Mediated Microfluidic Tandem Separation”的研究論文，開發(fā)了一個(gè)模塊化的串聯(lián)微流控分離平臺(tái)（如圖1所示），能夠?qū)⒍鄠€(gè)結(jié)合事件作為輸入，進(jìn)行邏輯計(jì)算，并產(chǎn)生兩個(gè)獨(dú)立的輸出，用于串聯(lián)微流控芯片的EVs亞群分離。該平臺(tái)利用雙適體識(shí)別的優(yōu)異選擇性和串聯(lián)芯片的靈活性，實(shí)現(xiàn)了腫瘤PD-L1 EVs和非腫瘤PD-L1 EVs的順序分離。因此，所開發(fā)的平臺(tái)不僅能有效區(qū)分癌癥患者和健康志愿者，還能為評估免疫異質(zhì)性提供新的線索。此外，捕獲的EVs可以通過DNA水解反應(yīng)高效釋放，與下游的質(zhì)譜分析兼容，進(jìn)行EV蛋白質(zhì)組分析?？偟膩碚f，這一策略有望分離出不同的EVs亞群，將EVs轉(zhuǎn)化為可靠的臨床生物標(biāo)志物，并準(zhǔn)確研究不同EVs亞群的生物學(xué)功能。文章通訊作者為廈門大學(xué)宋彥齡教授，第一作者為廈門大學(xué)碩士研究生盧銀珠與林冰倩博士。

圖1 DNA計(jì)算介導(dǎo)的微流控串聯(lián)實(shí)現(xiàn)PD-L1細(xì)胞外囊泡亞群分離的原理

該論文將肺癌患者和健康志愿者的血漿樣本用來研究所開發(fā)策略的臨床效用。將血漿樣本與親和探針和開關(guān)探針孵育后通入到串聯(lián)芯片中。如圖2A所示，對于T-Chip，癌癥患者捕獲的EVs數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康志愿者（t檢驗(yàn)：P = 0.0006）。而對于N-Chip，除了一些健康志愿者的數(shù)值較高外，兩類樣品的區(qū)別并不明顯（圖2B，t檢驗(yàn)：P = 0.02）。值得注意的是，對于N-Chip分離的PD-L1 EVs亞群，由于腫瘤患者中正常細(xì)胞產(chǎn)生的PD-L1 EVs可能因免疫逃逸而被分泌抑制，所以患者捕獲的EVs的平均量低于健康人。如果只是將同一樣本的兩種芯片信號簡單相加，而非順序分離，癌癥患者和健康志愿者的區(qū)別會(huì)被削弱（圖2C和2D，t檢驗(yàn)：P = 0.04，ROC曲線的AUC值為：T-Chip為0.9664，T-Chip + N-Chip為0.7731），這可能是因?yàn)槊庖弋愘|(zhì)性導(dǎo)致正常細(xì)胞分泌的PD-L1 EVs數(shù)量差異較大造成。這些結(jié)果表明，該策略不僅可以通過腫瘤PD-L1 EVs區(qū)分癌癥和正常人，同時(shí)可以獲得正常細(xì)胞來源的PD-L1 EV亞群的數(shù)量，以協(xié)助免疫異質(zhì)性評估。

圖2 臨床樣本中腫瘤來源和非腫瘤細(xì)胞來源PD-L1 EVs定量

總體而言，所開發(fā)的平臺(tái)通過EVs亞群的同時(shí)分離，有望能讓人們更好地理解EVs的生物學(xué)功能、以及對癌癥進(jìn)展、免疫反應(yīng)以及對免疫治療耐藥性的實(shí)時(shí)評估。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1002/smtd.202300516