虹科案例|CELESTA光源用于Craft-ID技術(shù)的共聚焦成像

01 什么是CRISPR？

基因攜帶著生物體的遺傳信息，是儲(chǔ)存著生命的種族、血型、孕育、生長、凋亡等過程的一套精確的密碼，決定了生物體的性狀。

隨著科學(xué)研究的深入，某些場景我們需要人為改變這些密碼，調(diào)控生物體的各種性狀，諸如性別、毛色、膚色等等（當(dāng)然性狀也受環(huán)境的影響），這種行為被稱為基因編輯。然而基因編輯并非易事，原因之一便是基因眾多，組成簡單生命最少要 265 到 350 個(gè)基因。這些基因上沒有標(biāo)簽，無從知道哪段基因?qū)?yīng)了什么性狀。而且基因存在于微小的 DNA 中，尺度在納米級(jí)別。微小而繁復(fù)，使得基因編輯就像是在一團(tuán)亂麻中找到想編輯的一段進(jìn)行微型手術(shù)，難度不言而喻。

而在1987年被科學(xué)家在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一段“無法確定功能”的DNA成為了基因編輯技術(shù)的一大契機(jī)，這段DNA后期被稱為CRISPR。CRISPR是生命進(jìn)化歷史上，細(xì)菌和病毒進(jìn)行斗爭產(chǎn)生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合到細(xì)菌，利用細(xì)菌的細(xì)胞工具為自己的基因復(fù)制服務(wù)，細(xì)菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進(jìn)化出 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)，利用這個(gè)系統(tǒng)，細(xì)菌可以不動(dòng)聲色地把病毒基因從自己的基因組上敲除，這是細(xì)菌特有的免疫系統(tǒng)，是古菌和細(xì)菌抵抗病毒等外源遺傳物質(zhì)入侵的一種獲得性免疫系統(tǒng)。微生物學(xué)家掌握了細(xì)菌擁有多種切除外來病毒基因的免疫功能，其中比較典型的模式是依靠一個(gè)復(fù)合物，該復(fù)合物能在一段RNA指導(dǎo)下，定向?qū)ふ夷繕?biāo)DNA序列，然后將該序列進(jìn)行敲除。許多細(xì)菌免疫復(fù)合物都相對(duì)復(fù)雜，其中科學(xué)家掌握了對(duì)一種蛋白Cas的操作技術(shù)，并先后對(duì)多種目標(biāo)細(xì)胞DNA進(jìn)行敲除。

通俗地說，CRISPR 技術(shù)是一種基因敲除（基因編輯）的技術(shù)。這種技術(shù)無視基因帶來的挑戰(zhàn)，它的強(qiáng)大之處在于能夠?qū)崿F(xiàn)精確的基因編輯，達(dá)到指哪打哪的程度，實(shí)現(xiàn)更高效率的基因敲除。在過去的十年里，圍繞著 CRISPR 技術(shù)的研究數(shù)量發(fā)生了爆炸式增長。這些研究帶來了諸多富有創(chuàng)新性的應(yīng)用，比如使用 CRISPR 技術(shù)對(duì) DNA 納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行工程化設(shè)計(jì)或是通過基因編輯來治療遺傳疾?。ɡ珑牋罴?xì)胞?。@些突破性研究極大地革新了傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)。

02 CELESTA光源用于 CRaft-ID 成像

混合基因敲除篩選（Pooled genetic knockout screens）在功能基因組學(xué)界廣泛用于鑒定與細(xì)胞表型相關(guān)的基因，而基因敲除方法中最典型的則為CRISPR 方法。但是這類篩選方法大多采用比較粗獷的篩選指標(biāo)，如生長速率、合成致死和熒光報(bào)告等方法。

近年來，隨著單細(xì)胞測序的普及，將其與混合基因敲除篩選法相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的定量分析，大大提升了篩選的通量。但是，這些方法仍然不能對(duì)亞細(xì)胞層面的表型進(jìn)行分析，如在成像層面能夠觀察到的時(shí)空分辨率下的一些表型。因此，將匯集的 CRISPR 基因篩選與細(xì)胞和亞細(xì)胞成像讀數(shù)相結(jié)合對(duì)于改善基于圖像的基因敲除研究中的表型定義至關(guān)重要。

2020年5月11日，加州大學(xué)圣地亞哥分校的華裔學(xué)者Gene W Yeo及其同事在Nature methods雜志上發(fā)表題為Pooled CRISPR screens with imaging on microraft arrays reveals stress granule-regulatory factors的研究論文。

在這篇文章中，作者將 Pooled CRISPR-Cas9 篩選與微筏陣列（又稱基因芯片）技術(shù)以及高內(nèi)涵成像相結(jié)合，開發(fā)了新技術(shù)“CRaft-ID”。作者選用了包含 >1,000 個(gè) RBPs 的 gRNA 文庫（> 12,000 個(gè) sgRNA）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了感染，然后在 20 個(gè)微筏陣列上進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，篩選得到 119050 個(gè)應(yīng)激刺激后的單細(xì)胞集落和 5262 個(gè)未進(jìn)行應(yīng)激刺激的對(duì)照集落。隨后采用自動(dòng)高分辨率共聚焦成像來識(shí)別應(yīng)激顆粒的調(diào)節(jié)因子，并開發(fā)了機(jī)器學(xué)習(xí)工具來識(shí)別 CRISPR 基因敲除后應(yīng)激顆粒豐度降低的基因克隆。

其中，微筏陣列的共聚焦成像是使用與 CrestOptics X-Light V2 L-FOV 旋轉(zhuǎn)盤共聚焦耦合的虹科 CELESTA 光源完成的。在這種大通量成像應(yīng)用中，顯微鏡光源需要具有極佳的光源強(qiáng)度和長時(shí)間工作的穩(wěn)定性，虹科CELESTA 光源滿足所有嚴(yán)苛要求。虹科 CELESTA 光源的405 nm，520 nm，546 nm和638 nm線分別用于激發(fā)DAPI，mCitrine，mCherry和Alexa Fluor 633的熒光。該篩選鑒定并驗(yàn)證了六種以前已知的應(yīng)激顆粒調(diào)節(jié)劑，以及17種RNA結(jié)合蛋白（RBP）。當(dāng)它們耗盡時(shí)，可減少亞砷酸鈉誘導(dǎo)的人體細(xì)胞中應(yīng)激顆粒，這為應(yīng)激顆粒提供了新的生物學(xué)見解。基于虹科 CELESTA 光源構(gòu)建的 CRaft-ID 篩選平臺(tái)拓展了 CRISPR 篩選在高內(nèi)涵成像中的應(yīng)用，使得我們能夠?qū)喖?xì)胞層面和細(xì)胞形態(tài)的表型進(jìn)行遺傳因子分析，而這些在以前是無法實(shí)現(xiàn)的。由于該方法采用的微筏陣列、通用的CRISPR文庫、現(xiàn)成的共聚焦成像技術(shù)和基于 PCR 的 DNA 測序，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。

03虹科CELESTA光源介紹

虹科CELESTA

虹科 CELESTA 和 CELESTA quattro 光源包括4-7個(gè)可單獨(dú)控制的固態(tài)激光光源陣列（在400-800nm范圍提供7個(gè)可選波長），并且支持快速切換。CELESTA 光引擎在1.5mm直徑光纖的遠(yuǎn)端出光，其7個(gè)激光器中的每一個(gè)都能提供約1W的輸出功率。

同樣，CELESTA quattro 光源以相同的輸出功率規(guī)格提供了一個(gè)具有性價(jià)比的4或5通道選擇。激光輸出與復(fù)雜的控制和監(jiān)測系統(tǒng)相結(jié)合，為旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡、空間分辨率轉(zhuǎn)錄組學(xué)和其它高級(jí)成像應(yīng)用提供所需的高清晰度性能。