基于膠原蛋白的柔性基底溶解微針設計

為了預防和逆轉皮膚衰老及治療皮膚病，人們做了很多努力，其中抗糖化食品、化妝品、能量皮膚嫩膚、口服膠原蛋白、真皮注射填充劑等顯示出一定的效果。然而，大多數(shù)方法都有一定的缺點。生物相容性聚合物微針（MNs）正在成為一種新型的無痛、無創(chuàng)、高效的經(jīng)皮給藥平臺，美容應用是MNs成功應用的最有前途的領域之一。

基于此，來自沈陽藥科大學的凌桂霞、張鵬共同開發(fā)出一種快速溶解的微針（DMN）貼片。采用兩步鑄模法，以皮膚細胞中所含的水解膠原蛋白（HC）為主要原料，以簡單、微創(chuàng)的方式遞送膠原蛋白，使被封裝的藥物在皮膚中釋放。通過優(yōu)化HC和輔助支撐材料的配方和比例，獲得了刺穿皮膚所需的機械強度，同時柔軟的基底允許應用的靈活性。DMNs可在15分鐘內(nèi)完全溶解在皮膚中，約8小時內(nèi)釋放，并且在使用時不會產(chǎn)生毒性和刺激。與口服和外用的效果不佳，以及經(jīng)皮注射的高風險相比，載藥的HC DMNs克服了傳統(tǒng)方法直接滲透和微創(chuàng)的缺點，使治療高效和安全。HC DMNs的成功制備和研究在該領域具有創(chuàng)新和現(xiàn)實意義，有望成為一種簡單、有效、大眾化的化妝品透皮給藥平臺。相關論文以“Collagen-based dissolving microneedles with flexible pedestals: A transdermal delivery system for both anti-aging and skin diseases”為題發(fā)表在Advanced Healthcare Materials期刊上。

針對目前藥妝領域的發(fā)展現(xiàn)狀，該研究旨在以HC為主要基質，結合幾種常用的生物相容性材料，克服HC單獨機械強度差的缺點，篩選制備一種貼合皮膚的柔性基底DMN貼片，用于膠原蛋白輸送，改善皮膚質量。將煙酰胺進一步加載到MNs中，與簡單的HC DMNs相比，有望同時實現(xiàn)逆轉皮膚衰老和治療皮膚病的雙重效果（圖1）。

圖1 MN貼片的制備過程及其在面部抗衰老中的應用

空白DMNs的制備

用HC與5種聚合物結合的溶液制備DMNs陣列。結果表明，HC/海藻酸鈉（SA）是制備DMNs的最佳配方。如圖2所示，展示了微針正面的直觀照片和顯微圖像（正面、側面）。

圖2 MN的直觀照片和顯微圖像（正面、側面）

帶柔性基底的負載煙酰胺DMNs的制備

為了制備負載煙酰胺的柔性基底DMN貼片，采用了兩步鑄造工藝。在第一步中，將藥物和HC/SA溶液的混合物填充到聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具中形成尖端。其次，將聚乙烯醇（PVA）涂覆到模具中形成基底（圖3）。貼片由高度為1000 μm，底部寬度為500 μm的矩形金字塔針組成。用數(shù)碼相機拍攝的照片顯示PVA基底柔軟且有彈性（圖4B）。此外，掃描電鏡（SEM）圖像證實，DMN的尖端是鋒利的，沒有任何可見的斷裂（圖4C和4D）。

圖3 柔性基底DMNs的制造工藝

圖4 DMNs的形態(tài)

傅里葉變換紅外光譜（FTIR）

圖5顯示了煙酰胺、HC/SA空白DMNs和負載煙酰胺的HC/SA DMNs的三個不同的紅外（IR）光譜。結果顯示，在光譜中觀察到HC、SA和煙酰胺的特征吸收峰。在DMNs的形成過程中沒有新的明顯吸收峰，煙酰胺在HC/SA DMNs中沒有降解和結構變化，表明該藥物與聚合物之間沒有不相容，意味著成功地制備了煙酰胺負載HC/SA DMNs。并且DMNs中的藥物含量沒有減少，從而確保了MNs在使用過程中能夠發(fā)揮預期的功能。

圖5 煙酰胺、HC/SA DMN和HC/SA DMN負載煙酰胺的FTIR光譜

力學測試

為了在臨床上成功、正確地使用MNs，需要在不彎曲、不斷裂的情況下植入皮膚內(nèi)。因此，機械強度對MNs的插入具有重要意義。如圖6所示，所制備的DMN可以承受每針12 N和0.12 N的力，超過了人體皮膚植入所需的力（≈ 0.1N），表明機械強度很高。

圖6 電子萬能試驗機原理圖（左）和DMN貼片在垂直力作用下的力學行為圖（右）

皮膚滲透性能和滲透深度

如圖7A和B所示，DMN貼片被插入錫箔中。去除后，錫箔上留下了完整的微孔陣列，而DMN尖端在顯微鏡下觀察時仍保持其原始形狀，幾乎沒有損傷。結果表明，DMN貼片具有一定的植皮能力。為了進一步驗證DMN貼片的植皮能力，以新鮮豬皮為材料，考察了DMN貼片的植皮能力。結果如圖7C所示。當含有臺盼藍的DMN貼片被插入豬皮膚時，皮膚上留下了完整的藍色微孔陣列。由此可見，MN貼片能成功穿透角質層，皮膚穿刺率可達100%。植入深度為DMNs植入處大鼠皮膚切片，蘇木精-伊紅（H&E）染色。如圖7D所示，組織切片可以很容易地顯示DMNs產(chǎn)生的微孔，針可以刺穿皮膚并產(chǎn)生更深的微通道，深入真皮。

圖7 DMNs的插入能力

DMNs的體內(nèi)外快速溶出

在體外，將DMN插入制備的瓊脂糖凝膠中，在不同的時間點取出，在顯微鏡下觀察。DMNs的溶解過程如圖8A所示?？梢钥吹紻MNs在凝膠中迅速溶解，針的所有部分在3分鐘內(nèi)溶解。在體內(nèi)，將具有柔性基底的DMN植入剃毛大鼠的背部皮膚，并在不同時間點取出。DMNs的溶解過程如圖8B所示。DMNs植入皮膚后開始溶解，整個DMNs在15分鐘內(nèi)完全溶解。這兩個結果都表明HC/SA DMNs具有快速溶解的能力。

圖8 DMNs的體內(nèi)外快速溶出

皮膚安全性和溶血

如圖9A所示，去除貼片后，應用DMNs的皮膚表面出現(xiàn)了明顯的微孔和局部紅斑，但沒有明顯的腫脹。隨著時間的延長，紅斑消失，皮膚表面幾乎恢復到原來的狀態(tài)。還進行了溶血試驗，以評估實際使用中負載煙酰胺的DMNs的潛在毒性效應。圖9B顯示了該實驗的結果。結果表明，煙酰胺MN溶液無任何毒性，與紅細胞孵育后的上清液如圖所示。因此，煙酰胺和HC/SA DMNs經(jīng)皮給藥是安全的。

圖9 皮膚安全性和溶血

含量測定及體外透皮吸收能力評價

采用Franz擴散細胞法研究了煙酰胺DMNs和乳膏在大鼠皮膚中的通透性。結果如圖10所示，DMNs制劑中煙酰胺的累積釋放量明顯高于乳霜制劑。HC/SA DMNs在8 h內(nèi)釋放約52%的煙酰胺，而乳膏制劑在8 h內(nèi)僅釋放約25.6%。煙酰胺在接受池的累積透皮釋放量（%）為52%，說明殘留的48%可產(chǎn)生局部效應。

圖10 煙酰胺DMNs的體外透皮釋放與乳膏應用的比較

羥脯氨酸的測定

如圖11所示，與未處理的對照組相比，MN組皮膚的水解和顏色發(fā)育顯示羥基脯氨酸水平（通常被認為代表膠原蛋白的產(chǎn)生量）增加。此外，顯微鏡下觀察應用于大鼠皮膚的DMN陣列，只留下針根甚至消失，表明HC針尖已經(jīng)溶解在皮膚中，這也證明了膠原蛋白成功遞送到皮膚。

圖11 對照組和實驗組皮膚羥脯氨酸含量

綜上所述，該研究篩選了幾種以膠原為主要成分制備DMNs的配方，確定16% w/v HC/SA（7:3）的溶液最適合制備形態(tài)完整、機械強度好、成本合適的膠原DMNs。PVA制備的基底使MN易于彎曲并貼合皮膚。此外，該研究首次證明在DMNs中添加煙酰胺是可行的。負載煙酰胺的MNs陣列可以穿透豬和大鼠的皮膚，達到一定的深度，實現(xiàn)膠原蛋白的真皮遞送。同時，其溶出速度快，生物安全性高，使用方便，附著力強。此外，煙酰胺在DMNs中的皮膚滲透性優(yōu)于乳膏制劑，滲透性為52%，保留率為48%。因此，無論是經(jīng)皮給藥還是局部作用，將來都有一定的效果。在體內(nèi)抗衰老效果評價中，膠原蛋白MNs也初步顯示出提高皮膚膠原蛋白含量的能力。在移除DMN貼片后，皮膚自然愈合，沒有任何感染跡象。

審核編輯：劉清