外泌體因其具有豐富的生物信息和高穩(wěn)定性,被認(rèn)為是結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)診斷的新型生物標(biāo)志物。然而,對于具有特異性表面受體的外泌體的準(zhǔn)確檢測限制了其臨床應(yīng)用。
近期,山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院杜魯濤教授課題組在Small期刊上發(fā)表了題為“Construction of Exosome SORL1 Detection Platform Based on 3D Porous Microfluidic Chip and its Application in Early Diagnosis of Colorectal Cancer”的文章,構(gòu)建了3D多孔海綿微流控芯片上的外泌體富集平臺,該芯片的外泌體捕獲效率約為90%。此外,研究人員通過深度質(zhì)譜分析后進行多級表達篩選,揭示了CRC特異性外泌體膜蛋白(SORL1),并進一步設(shè)計了一種基于特定量子點標(biāo)記的SORL1檢測方法,通過對64張熒光圖像進行特征提取,建立了集成分類系統(tǒng)。使用該系統(tǒng)的曲線下面積(AUC)為0.99,明顯高于使用傳統(tǒng)生物標(biāo)志物。上述系統(tǒng)在處理早期、進展期和CEA陰性結(jié)直腸癌患者時表現(xiàn)出類似的診斷性能。
為克服近表面流體動力學(xué)阻力,提高表面體積比,并增強微通道內(nèi)的傳質(zhì),研究人員設(shè)計并構(gòu)建了新型多孔海綿芯片。該平臺由簡單制備而成的聚二甲基硅氧烷(PDMS)預(yù)聚體、固化劑、研磨NaCl微粒生成硬模板。通過調(diào)節(jié)模板與PDMS預(yù)聚體的混合比例和NaCl粉末的直徑,從而改變微流控芯片中PDMS海綿的多孔結(jié)構(gòu)(圖1A)。針對CRC患者,通過質(zhì)譜蛋白組學(xué)分析篩選到一個新的外泌體表面蛋白SORL1,并通過蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting,WB)和流式細胞術(shù)檢測進行驗證。接著,利用構(gòu)建的多孔海綿芯片和硅量子點(Si-QD)共軛捕獲抗體檢測CRC患者血清中外泌體SORL1的表達(圖1B)。最后,將獲得的熒光圖像使用基于AI的集成分類系統(tǒng)進行分析和量化,該系統(tǒng)可以高效準(zhǔn)確地區(qū)分CRC患者和非CRC人群(圖1C)。
圖1 3D多孔海綿芯片的構(gòu)建及外泌體的分析
為了實現(xiàn)對CRC來源外泌體的高靈敏度檢測,研究人員首先使用球磨機研磨NaCl顆粒形成均勻的粉末。如圖2A所示,未處理的NaCl平均粒徑在粉碎后由176μm ± 35μm減小到3.35μm ± 0.87 μm,說明粉碎方法可以有效降低NaCl平均粒徑。多孔海綿芯片的實物圖和渲染圖如圖2B所示。芯片(左上面板)中心的白色區(qū)域是多孔PDMS海綿結(jié)構(gòu),在相鄰的多孔結(jié)構(gòu)之間具有凹槽,以破壞層流。多孔PDMS結(jié)構(gòu)的表面和斷面掃描電子顯微鏡(SEM)圖像也顯示了具有相互連通的孔洞的多孔形貌。該研究利用PDMS可以非特異性地大量吸附蛋白質(zhì)的原理,將抗體高效地固定在芯片內(nèi)部的多孔PDMS結(jié)構(gòu)上。使用CD9抗體進行固定以捕獲外泌體,并選擇兩種抗體固定方法:分別在37℃孵育2 h和4℃孵育過夜。為了探究最佳的抗體固定方法,使用熒光顯微鏡對芯片進行熒光成像。以FITC二抗的熒光強度用來評價一抗固定效果。對于BSA和PBS孵育的兩組芯片,非特異性熒光吸附較弱,兩組芯片的熒光強度均遠低于CD9抗體孵育組(圖2C)。37℃孵育2 h后的抗體固定量是4℃孵育過夜的4.797倍,表明37°C孵育2 h是抗體固定的最佳條件。
隨后,研究人員通過超速離心法從SW1116細胞的培養(yǎng)上清中獲得純化的結(jié)腸癌外泌體。采用透射電子顯微鏡(TEM)、Western blotting和納米顆粒跟蹤分析(NTA)3種應(yīng)用最廣泛的外泌體分析方法對分離的外泌體進行性質(zhì)表征。圖2D顯示了標(biāo)準(zhǔn)的外泌體形態(tài),包括圓形或橢球形。采用NTA分析外泌體濃度和平均直徑。粒徑為103.1 nm,峰濃度為7.7 × 10?,與文獻報道一致(圖2E)。利用Western blotting鑒定出癌細胞和外泌體膜靶蛋白CD9、CD63和TSG101(圖2F)。隨著樣品的持續(xù)進樣,芯片的實時熒光捕獲效率逐漸降低。20 μL時熒光強度(ΔFL)最高為97.45% ± 2.29%,100 μL時ΔFL最低為74.45% ± 8.8%,ΔFL的平均熒光效率為85.25% ± 5.51%(圖2G)。多孔海綿芯片的NTA捕獲效率為80.12% ± 3.45%,而超速離心僅為15.5% ± 1.70%(圖2H)。熒光圖像進一步揭示了外泌體具有較高的捕獲效率(圖2I)。NTA和熒光分析得到的結(jié)果一致,證明了多孔海綿芯片分離和捕獲外泌體的高效性。
圖2 外泌體和3D多孔海綿芯片的表征 接著,研究人員初步選取8例健康人(HCs)和8例CRC患者的血清樣本,對收集到的血清外泌體進行無標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)分析。與HCs相比,CRC患者中共鑒定出367個差異表達蛋白,其中上調(diào)蛋白136個,下調(diào)蛋白231個,包括FTH1、RPS8、CFH、PIGR、PSMA3和CCT8(圖3A)。在CRC和正常樣本中分別有25個蛋白和62個蛋白特異性表達。
為了驗證篩選出的分子是否位于外泌體膜表面,研究人員使用SW620細胞來源的外泌體進行流式檢測。結(jié)果顯示,與對照組相比,CRC樣本中SORL1和PSMA3的熒光強度較高,而CCT8、PIGR和CAT表達在基礎(chǔ)水平,表明SORL1和PSMA3定位于外泌體膜表面(圖3B)。接下來,通過Western blotting分析測定細胞上清和血清樣本外泌體中SORL1和PSMA3蛋白的表達水平。結(jié)果顯示,在CRC細胞培養(yǎng)上清中可以穩(wěn)定檢測到SORL1和PSMA3(圖3C)。此外,與HCs相比,SORL1在CRC患者血清中表現(xiàn)出更高的表達,而PSMA3的表達無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3D)。通過對27例CRC患者和27例HCs血清中外泌體SORL1的定量檢測,研究人員證實了CRC患者血清中SORL1的水平顯著高于HCs,表明外泌體SORL1在區(qū)分結(jié)直腸癌患者和非結(jié)直腸癌人群中的潛在診斷價值(圖3E)。
圖3 無標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)對外泌體蛋白的分析
為了利用3D微流控芯片有效定量SORL1的表達,研究人員制備了Si-QD偶聯(lián)的SORL1抗體(Si-QD-SORL1)。TEM結(jié)果表明Si-QD和SORL1抗體融合,成功合成了Si-QD-SORL1復(fù)合物(圖4A)。UV-vis光譜掃描結(jié)果證明Si-QD在357 nm處有明顯的吸收峰,加入SORL1抗體形成Si-QD-SORL1復(fù)合物后,吸收峰明顯減弱(圖4B)。將3D多孔芯片與Si-QD-SORL1結(jié)合后,在室溫下放置10min、30min、50min、70min和90 min后評估熒光強度穩(wěn)定性。結(jié)果表明,在所考察的時間范圍內(nèi),熒光強度無明顯變化,表明Si-QD-SORL1復(fù)合物具有較高的穩(wěn)定性(圖4C)。為了確認(rèn)注入芯片的樣品熒光強度是飽和且穩(wěn)定的,研究人員測試了多孔芯片組合的最佳Si-QD-SORL1的體積和濃度。根據(jù)圖4D所示,芯片從左到右有3個捕獲區(qū)域,捕獲區(qū)域的熒光分布均勻穩(wěn)定,能夠準(zhǔn)確反映外泌體SORL1的整體表達情況(圖4E)。此外,研究人員對外泌體進行PKH67-green染色,觀察到Si-QD-SORL1(紅色信號)與CD9結(jié)合的外泌體共定位(圖4F)。這證實了熒光信號是通過兩步免疫反應(yīng)檢測通道中的量子點產(chǎn)生的。
圖4 Si-QD-SORL1及外泌體檢測系統(tǒng)的表征
為了更好地理解和準(zhǔn)確判讀熒光成像結(jié)果,研究人員通過激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)高分辨率熒光篩選,開發(fā)、訓(xùn)練和優(yōu)化了圖像檢測模塊。首先,為了提高集成系統(tǒng)的解譯效果,系統(tǒng)將影像劃分為64個圖斑,并基于亮度、方差和均值3個特征獲取信息(圖5A)。接下來,研究人員招募了一個獨立、匹配和隨機分配的人群隊列,包括106名CRC和100名HC,并將其分為訓(xùn)練和測試階段。在訓(xùn)練階段采用隨機森林分析建立臨床判別模型,在測試階段采用交叉驗證。為了驗證外泌體SORL1區(qū)分CRC患者和HC的能力,研究人員隨機選取了27例CRC患者和25例HC患者作為訓(xùn)練集,其余樣本在測試集中進行表征。結(jié)果顯示,與健康人相比,SORL1在CRC患者樣本中顯著上調(diào)(圖5B)。91.14%的CRC患者(79人中有72人)和100%的HCs被正確診斷(圖5C),同時具有達到0.99的工作特征曲線下面積(AUC)(圖5D)。同時,研究人員也考察了外泌體SORL1在其他幾個特定人群。他們檢測了該方法對80例早期CRC患者(期和Ⅱ期)的診斷性能。結(jié)果表明,早期CRC患者和HCs的樣本可以被有效區(qū)分(圖5E),其診斷靈敏度達到97.50%,AUC為0.99(圖5F、5G),具有較好的診斷準(zhǔn)確性。
目前對于50歲以下的低中危人群的CRC篩查尚未達成(young CRC patients,yCRC)。在yCRC人群中,該方法的結(jié)果清楚地揭示了外泌體SORL1可以區(qū)分yCRC患者和HCs,診斷敏感性和特異性均達到100%(圖5H)。但對于yCRC的診斷結(jié)果可能需要進一步的研究,因為該研究僅有12例yCRC患者。在該研究中,研究人員同時增加了35個腫瘤樣本,包括12個胃癌(gastric cancer,GC)、12個肺癌(lung cancer,LC)和11個胰腺癌(pancreatic cancer,PANC)樣本,以驗證SORL1是否在CRC中特異性表達。利用上述35例腫瘤樣本,隨機選取35例健康對照者,共形成70例樣本,構(gòu)成非CRC對照組。結(jié)果表明,SORL1可以從非CRC癌癥患者中診斷CRC患者,靈敏度和特異度分別達到93.67%和96.15%(圖5I)。
圖5 基于AI分類的外泌體SORL1的診斷性能
單一標(biāo)志物CEA檢測常用于血液學(xué)CRC篩查。結(jié)果顯示,CEA的診斷敏感性為47.17%,在106例CRC患者中僅有50例被正確診斷(圖6A、6B)。而超過一半的早期CRC病例CEA陰性,表明其在早期CRC患者中的診斷能力較差。進一步研究發(fā)現(xiàn),在56例CEA陰性患者中,52例患者被本研究提出的方法正確診斷(圖6C),診斷AUC為0.99(圖6D)。
該研究的方法的潛在應(yīng)用在兩個病例中得到了肯定,這兩個病例通過該研究發(fā)展的方法得以正確診斷,而其被CEA、上皮細胞粘附分子(EpCAM)和結(jié)腸鏡檢查遺漏了(圖6E)。一號病人因排便不規(guī)律而入院。結(jié)腸鏡檢查顯示無明顯惡性特征,診斷為良性息肉(圖6F)。然而,術(shù)后病理報告證實了高級別上皮內(nèi)瘤變(圖6F)。第二例患者也出現(xiàn)了類似的情況,該患者使用基于SORL1的微流控芯片方法診斷為CRC,病理證實為原位I期CRC,但CEA和EpCAM未發(fā)現(xiàn)(圖6E、6F)。這些結(jié)果有力地證明了外泌體SORL1在檢測微小腫瘤和早期CRC方面的優(yōu)勢。
圖6 通過SORL1等方法診斷CRC
綜上所述,該研究通過在微流控芯片上構(gòu)建3D多孔海綿結(jié)構(gòu),將其與新發(fā)現(xiàn)的CRC分子標(biāo)記物SORL1、量子點檢測方法和機器學(xué)習(xí)智能分析系統(tǒng)相結(jié)合,建立了一種新型特異高效的檢測技術(shù)平臺。該平臺能夠?qū)崿F(xiàn)外泌體在芯片表面的高度富集,便于快速捕獲和定量檢測。新建立的智能圖像判別系統(tǒng)能夠高效地實現(xiàn)CRC的早期診斷,為CRC的早期檢測提供了新方法和新途徑。
審核編輯:劉清
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原文標(biāo)題:基于3D多孔微流控芯片的外泌體檢測平臺,用于結(jié)直腸癌早期診斷
文章出處:【微信號:Micro-Fluidics,微信公眾號:微流控】歡迎添加關(guān)注!文章轉(zhuǎn)載請注明出處。
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