一文詳解TIRF和SPR成像系統(tǒng)的環(huán)形照明

眾所周知，入射角的正弦值與折射角的正弦值滿(mǎn)足如下關(guān)系：n1sin（i）=n2sin(r) ，假設(shè)n1=1.52（玻璃），n2=1（空氣），當(dāng)折射角度等于90度時(shí)，對(duì)應(yīng)的入射角度是臨界角：i=arcsin(1/1.52)，臨界角大概在41度左右。當(dāng)入射角大于或等于臨界角的情況下，此時(shí)折射光線消失，即發(fā)生了全反射，

有人總結(jié)了全反射的九大應(yīng)用：

1、光導(dǎo)纖維；2、全內(nèi)反射熒光顯微鏡；3、全內(nèi)反射是汽車(chē)雨量傳感器的工作原理，控制擋風(fēng)玻璃雨刮器；4、光的空間濾波；5、雙筒望遠(yuǎn)鏡中的棱鏡使用全內(nèi)反射顯示直立圖像；6、一些多點(diǎn)觸摸屏幕使用全內(nèi)反射拾取多個(gè)目標(biāo)；7、前房角鏡檢查采用全內(nèi)反射來(lái)觀察眼睛角膜和虹膜之間形成的解剖角度；8、步態(tài)分析儀器使用受抑全內(nèi)反射分析嚙齒動(dòng)物的足跡；9、光學(xué)指紋設(shè)備使用受抑全內(nèi)反射記錄人的指紋圖像。

全內(nèi)反射熒光顯微鏡（total internal reflection fluorescent microscope，TIRFM），利用光線全反射后在介質(zhì)另一面產(chǎn)生衰逝波的特性，激發(fā)熒光分子以觀察熒光標(biāo)定樣品的極薄區(qū)域，觀測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍通常在200nm以下。因?yàn)榧ぐl(fā)光呈指數(shù)衰減的特性，只有極靠近全反射面的樣本區(qū)域會(huì)產(chǎn)生熒光反射，大大降低了背景光噪聲干擾觀測(cè)標(biāo)的，故此項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面物質(zhì)的動(dòng)態(tài)觀察。

TIRFM的實(shí)現(xiàn)是通過(guò)改變激光的入射角來(lái)實(shí)現(xiàn)的，按技術(shù)TIRF顯微鏡分為兩種：棱鏡型和物鏡型。棱鏡型TIRF顯微鏡采用棱鏡產(chǎn)生衰逝波，并用物鏡收集熒光成像。物鏡型TIRF顯微鏡采用大數(shù)值孔徑物鏡產(chǎn)生衰逝波，同時(shí)采用物鏡收集熒光成像。與棱鏡型TIRF顯微鏡相比，物鏡型TIRF的應(yīng)用更為廣泛，它的基本結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2：

圖2全內(nèi)反射成像的基本原理（熒光沒(méi)有特意標(biāo)出）

入射光線通過(guò)物鏡中心的一邊以大于全反射的角度匯聚到樣品一點(diǎn)，然后經(jīng)過(guò)物鏡的另外一側(cè)傳播（如果是熒光樣品，出射的光線波長(zhǎng)不一樣）。通常要求從全內(nèi)反射顯微物鏡出射的激發(fā)光能夠以觀察區(qū)域?yàn)橹行睦@系統(tǒng)光軸旋轉(zhuǎn),從而實(shí)現(xiàn)全角度的全反射照明,常規(guī)的作法是使用一個(gè)二維振鏡組配合一個(gè)大口徑透鏡將入射激發(fā)光聚焦在全內(nèi)反射顯微鏡物的后焦面上并使其繞光軸環(huán)狀掃描,進(jìn)而達(dá)到全角度的全反射照明的目的。這個(gè)方案對(duì)于二維振鏡組的控制電路要求極高,不僅要求其具有很高的同頻和響應(yīng)速度，因此,全內(nèi)反射熒光顯微鏡中掃描模塊設(shè)計(jì)復(fù)雜，很難實(shí)現(xiàn)到實(shí)際儀器系統(tǒng)中。

解決的方案之一是使用環(huán)形錐透鏡實(shí)現(xiàn)環(huán)形照明，如圖3所示：

圖3 圓錐透鏡的工作原理

使用圓錐透鏡是可以產(chǎn)生環(huán)形照明，而且環(huán)的尺寸在不同位置尺寸可以改變。但是這種結(jié)構(gòu)也是很難使用到TIR顯微鏡系統(tǒng)，因?yàn)楹茈y得到平行光的環(huán)形照明，其次當(dāng)改變環(huán)形的尺寸的時(shí)候，位置要發(fā)生變化，即系統(tǒng)的參數(shù)發(fā)生變化，很難實(shí)際使用。因此國(guó)內(nèi)外的科學(xué)工作者做了很多努力解決這個(gè)問(wèn)題（如使用SLM或者DMD）。例如，浙江大學(xué)劉旭團(tuán)隊(duì)授權(quán)的發(fā)明專(zhuān)利“基于數(shù)字微鏡元件的全反射顯微鏡環(huán)形掃描方法和裝置”，如圖4所示：

圖4基于數(shù)字微鏡元件的全反射顯微鏡環(huán)形掃描方法和裝置

使用數(shù)字微鏡是一個(gè)不錯(cuò)的實(shí)現(xiàn)環(huán)形照明的方案，但也是有一定的局限性，DMD的價(jià)格昂貴到不是主要問(wèn)題，主要是由于衍射和光源能量損失比較大。西安交通大學(xué)雷銘教授在德國(guó)工作期間，2010年與Andreas Zumbusch在Optical Letters發(fā)表了采用W-錐鏡實(shí)現(xiàn)了環(huán)形照明，圖5：

圖5使用W-錐鏡的全反射環(huán)形照明

W-錐鏡的全反射環(huán)形照明是非常聰明的一個(gè)方案，重要的是在平行光路中工作，非常容易改變環(huán)形照明的尺寸。視頻1可以看到改變環(huán)尺寸的過(guò)程：

視頻1 W-錐鏡的工作示意圖

這個(gè)技術(shù)是來(lái)源于1986年美國(guó)的一項(xiàng)專(zhuān)利技術(shù)，如圖6所示：

圖6W-錐鏡的環(huán)形照明的專(zhuān)利信息

雷銘教授在圖5發(fā)表的文章中，非常尊重歷史的引述了專(zhuān)利信息作為參考文獻(xiàn)，8. G. T. Sincerbox, H. W. Werlich, and B. H. Yung, “Brightfield/darkfield microscope illuminator,” U.S. patent 4,585,315(April 29, 1986)。

這里還有一個(gè)小小的插曲，雷銘教授曾經(jīng)談起他使用W-錐鏡的經(jīng)歷，在沒(méi)有讀到美國(guó)這個(gè)專(zhuān)利的情況下，一天和同事討論出W-錐鏡的方案，兩個(gè)人非常的高興準(zhǔn)備申請(qǐng)專(zhuān)利，沒(méi)有想到檢索發(fā)現(xiàn)Sincebox已經(jīng)在86年申請(qǐng)了專(zhuān)利。

W-錐鏡的方案在1986年就提出來(lái)了，沒(méi)有引起多數(shù)科學(xué)工作者的注意和使用，原因是作為非球面的內(nèi)、外錐加工精度要求還是比較高，2012年筆者也是試圖使用這個(gè)環(huán)形照明方案用在SPR顯微鏡中，遺憾的是很難找到合適的加工商沒(méi)有實(shí)現(xiàn)。

隨著光學(xué)加工的水平不斷的提高，平行光的環(huán)形照明使用在TIRF和SPR顯微鏡中終會(huì)實(shí)現(xiàn)。

PS：

SPR和TIR成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)非常的類(lèi)似，也是有環(huán)形照明的需求。一般情況下SPR共振角度比全反射角度要大一些。因此在推送內(nèi)容的主體部分沒(méi)有特意提及SPR成像系統(tǒng)。另外文中關(guān)于TIR和TIRF也是沒(méi)有特意的區(qū)分，因?yàn)橄到y(tǒng)結(jié)構(gòu)基本一樣，主要區(qū)別是熒光系統(tǒng)需要使用二相色鏡、激發(fā)和發(fā)射濾光片而已。這里作為附錄簡(jiǎn)單介紹一下SPRI：亞利桑那州立大學(xué)的研究人員首次利用表面等離子共振（SPR）效應(yīng)開(kāi)發(fā)了一款等離子激元散射顯微鏡（PSM），并成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)分子（本研究中為蛋白質(zhì)）的成像。目前，該工作于2020年9月21日以題目為“Plasmonic scattering imaging of single proteins and binding kinetics”發(fā)表在Nature Methods上。其中使用的儀器系統(tǒng)就是SPR顯微鏡，如圖8右所示：

圖7TIR和SPR成像系統(tǒng)的對(duì)比

從圖7的對(duì)比可以清楚看到兩種系統(tǒng)都是使用環(huán)形照明。






審核編輯：劉清