談到顯微成像系統(tǒng),常常會用分辨率來評價(jià)成像能力的高低,那分辨率到底指的是什么,又怎樣計(jì)算呢?其實(shí)對于一個(gè)特定的顯微成像系統(tǒng),分辨率要從兩個(gè)方面來考慮,一種是光學(xué)系統(tǒng)的分辨率—光學(xué)衍射極限,另一種就是成像探測器的圖像分辨率,兩個(gè)概念缺一不可,下面將對這兩種分辨率及其對成像結(jié)果的影響進(jìn)行詳細(xì)說明。
1、相機(jī)的圖像分辨率
我們在購買相機(jī)的時(shí)候,常常會說這個(gè)相機(jī)的分辨率是500萬,800萬,或者4k2k,這里說的分辨率,其實(shí)指的是成像探測器的圖像分辨率,就是探測器芯片上的總像素?cái)?shù)量。
探測器芯片的另一個(gè)非常重要的指標(biāo)就是像元大小,對于sCMOS探測器來說,一個(gè)像素的大小通常是在幾個(gè)um。以科研級熒光顯微鏡通常使用的Hamamatsu Flash 4.0 sCMOS探測器為例,像素尺寸為6.5um,相機(jī)分辨率是2048x2048,如果顯微鏡的總放大倍數(shù)為10倍,那么1um的物經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)放大為10um的像,這樣的像會由10um/6.5um=1.54個(gè)像素來顯示,用實(shí)際物體來理解,圖像中的一個(gè)像素點(diǎn)表示的實(shí)際距離為650nm,像元尺寸越小,圖像分辨率越高。
相機(jī)的圖像分辨率=2*像素大小/放大倍數(shù),則對上面的例子來說,相機(jī)的圖像分辨率=2*6.5um/10=1.3um。
2、光學(xué)衍射極限
這里簡單介紹下什么是“普通熒光顯微鏡的分辨率”—光學(xué)衍射極限(Abbe diffractionlimit)。
圖. 光學(xué)衍射極限示意圖
如上面的簡圖所示,黑色箭頭表示的物體 AB 經(jīng)過物鏡等之后在相機(jī)上成像。由于光的衍射,物體上的點(diǎn)如A、B,在相機(jī)上并不是單獨(dú)的點(diǎn),而是一個(gè)個(gè)有一定大小的斑,被稱為夫瑯禾費(fèi)衍射斑,如右側(cè)的同心圓所示。根據(jù)光學(xué)中的瑞利判據(jù),1873 年,德國物理學(xué)家恩斯特·阿貝(Ernst Abbe)推算出,顯微鏡能分辨的物體上兩點(diǎn) A、B 的最小距離 h 為:波長/(2*N.A.)。
這個(gè)公式就是光學(xué)顯微鏡的分辨率公式,或稱為光學(xué)衍射極限。(注意此處的分辨率與通常說的顯示器分辨率含義不同)其中,為光的波長,n為物方的折射率,θ為物體與物鏡邊緣連線和光軸的夾角。也常稱為數(shù)值孔徑,簡寫為NA。
目前常用的高倍物鏡NA為 1.49,所以對于可見光,比如波長 500 納米的綠光,計(jì)算得到顯微鏡的分辨率約為 200 納米。因此可知,即使再提高物鏡的放大倍率,也不能提高顯微鏡的分辨率。而 200 納米這個(gè)數(shù)值也就通常被人稱作衍射極限。如上圖中(a)(b)(c)所示,當(dāng)兩個(gè)點(diǎn)逐漸靠近到一個(gè)程度時(shí),我們就很難分辨該光斑是一個(gè)點(diǎn)還是兩個(gè)點(diǎn)疊加在一起了(如圖(c)),更別提其空間/立體位置關(guān)系了。
3、顯微成像系統(tǒng)的分辨率
了解了上面兩種分辨率的原理,那已知一個(gè)顯微成像系統(tǒng)的參數(shù),就可以計(jì)算出這個(gè)系統(tǒng)的分辨率究竟是多少了。
例如:一臺生物顯微鏡,使用的物鏡為放大倍數(shù)20倍,N.A.=0.4,光路中沒有其他放大,使用的相機(jī)為Hamamatsu Flash 4.0 sCMOS,像素尺寸6.5um。探測的熒光波長按550nm計(jì)算。
系統(tǒng)的光學(xué)分辨率=550nm/(2*0.4)=688nm
系統(tǒng)探測器的圖像分辨率=2*6.5um/20=650nm
比較兩者,光學(xué)分辨率較差,所以對于這臺顯微成像系統(tǒng),xy方向分辨率為688nm。
當(dāng)然,談到顯微成像系統(tǒng),就離不開對樣品的討論,生物樣品特定結(jié)構(gòu)的染色密度同樣會對最終的成像分辨率有決定性的影響,這里由于篇幅原因就不對這方面做具體的展開,后續(xù)文章中會對染料及染色密度對熒光顯微成像系統(tǒng),特別是超分辨率成像系統(tǒng)的分辨率影響做具體的介紹。
審核編輯:湯梓紅
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原文標(biāo)題:顯微成像系統(tǒng)分辨率的計(jì)算
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