用于定量相位和散射成像的透射結(jié)構(gòu)照明顯微鏡

定量相位顯微鏡（QPM）利用物波的相位信息，不僅可以提供相差圖像，還可以提供樣品三維形貌和折射率分布的定量信息。

更高的空間分辨率有利于解析樣本的更精細(xì)細(xì)節(jié)。然而，在設(shè)計(jì)顯微物鏡時(shí)，通常需要在更高的空間分辨率和更小的視場(chǎng)（FOV）之間取得平衡。結(jié)構(gòu)照明顯微鏡（SIM）是一種寬視場(chǎng)、微創(chuàng)、超分辨率成像技術(shù)，可以將無法分辨的高頻信息降檔為系統(tǒng)支撐區(qū)域的低頻下降，如圖1所示。

圖 1

此外，SIM還被證明具有與共聚焦顯微鏡相當(dāng)?shù)?a href="http://srfitnesspt.com/v/tag/4854/" target="_blank">光學(xué)切片能力。因此，SIM在生物醫(yī)學(xué)成像中得到了廣泛的應(yīng)用，特別是活細(xì)胞的長期觀察動(dòng)力學(xué)。到目前為止，具有結(jié)構(gòu)照明的QPM已經(jīng)使用光柵或空間光調(diào)制器（SLM）實(shí)現(xiàn)，并且相位成像模式通常與其他成像模式（如熒光成像）隔離開來。因此，由于同一樣本缺乏多維信息，QPM的值受到限制。

在本文中，我們提出了一種基于DMD的光學(xué)顯微鏡，它集成了多種成像模式。首先，基于結(jié)構(gòu)照明的QPM能夠在沒有熒光標(biāo)記的情況下提供樣品的定量相位圖像。其次，相干SIM提供具有分辨率增強(qiáng)的未標(biāo)記樣品的吸收/散射圖像。第三，該系統(tǒng)與熒光成像模式集成，可提供同一樣品的額外（功能/生化）信息。

系統(tǒng)原理

該系統(tǒng)的原理圖如圖2所示，使用二極管激光器作為照明源。在依次被反射鏡M1和M2反射后，激光束被耦合到光纖中并發(fā)送到裝置。在輸出端，來自光纖的光被鏡頭L1準(zhǔn)直，并由反射鏡M3引導(dǎo)至DMD（UPOLabs的HDSLM756D空間光調(diào)制器，1920×1080像素，像素大小7.56μm），入射角為24°。在DMD上，兩組具有正交方向和五相位移的條紋圖案依次加載到DMD中。DMD上顯示的條紋圖案由望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)L2-L3和L4-MO1進(jìn)一步中繼，并最終投射到放置在MO1和MO2公共焦平面上的樣品上。

在條紋照明下，然后由望遠(yuǎn)鏡系統(tǒng)MO2-L5將樣品成像到圖像平面。相機(jī)CCD1記錄不同成像模式的衍射圖像，qDIC中的散焦圖像和相干SIM中的聚焦圖像。同時(shí)，來自樣品的發(fā)射光（熒光）將沿照明光的相反方向傳播，然后被相機(jī)CCD2收集。相機(jī)CCD1和CCD2與DMD同步，產(chǎn)生每秒15幀的采集速度，為每個(gè)通道提供亞秒級(jí)的成像速度。

圖 2

實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

qDIC活細(xì)胞顯微鏡成像

在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，進(jìn)行了驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，以證明在沒有熒光標(biāo)記的情況下對(duì)活樣品成像的qDIC。為此，使用活小鼠脂肪干細(xì)胞作為相樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，通過比較表明，qDIC不僅可以可視化高對(duì)比度的透明樣品，還可以為我們提供樣品光程差（OPD）的定量信息。

圖 3 小鼠脂肪干細(xì)胞的qDIC成像。

SiO2 顆粒的相干 SIM 成像

在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)SiO2磁珠（直徑：500 nm）進(jìn)行成像，證明了使用相干結(jié)構(gòu)照明的分辨率增強(qiáng)非熒光/散射成像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示.很明顯，相干結(jié)構(gòu)照明在SiO2磁珠上提供了高分辨率圖像。

圖 4 500nm SiO2 磁珠的相干 SIM 成像。

百合花藥的雙模態(tài)（散射/熒光）成像

在第三個(gè)實(shí)驗(yàn)中，以百合花藥為樣本，展示了所提出的SIM裝置的雙模態(tài)（非熒光散射/熒光）成像能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示.熒光圖像經(jīng)彩色濾光片濾波后由相機(jī)CCD2捕獲，與使用均勻照明獲得的寬視場(chǎng)圖像相比，SIM圖像顯示出更詳細(xì)的結(jié)構(gòu)和更清晰的背景。此外，熒光圖像在干凈的背景中顯示了清晰的花粉結(jié)構(gòu)（具有自發(fā)熒光）。SIM圖像（透射）和熒光圖像（反射）對(duì)于同一樣品具有相反的對(duì)比度，這一點(diǎn)也很明顯。

圖 5 百合花藥的雙模態(tài)成像。

審核編輯：劉清