基于微流控的納米細(xì)胞芯片，用于肺癌免疫治療的精準(zhǔn)預(yù)測(cè)

免疫療法是臨床上最具有前景的腫瘤治療方式之一。該療法采用PD-L1抑制劑等免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI），重新激活癌癥患者體的免疫細(xì)胞，提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和清除能力。但在臨床中，僅有部分患者能從免疫治療中獲益。大量研究表明，使用單一生物標(biāo)記物，如PD-L1表達(dá)，并無法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)患者對(duì)ICI的反饋。臨床常規(guī)組織活檢方式，受限于取樣位置和動(dòng)態(tài)分析，無法提供足夠精細(xì)的時(shí)空信息，也無法準(zhǔn)確評(píng)估腫瘤的異質(zhì)性，導(dǎo)致對(duì)腫瘤發(fā)生和免疫治療過程中的細(xì)胞反應(yīng)知之甚少。如何精準(zhǔn)預(yù)測(cè)免疫治療的療效，成為了提高免疫治療效率亟待解決的首要問題。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，針對(duì)該臨床問題，北京航空航天大學(xué)常凌乾教授團(tuán)隊(duì)，與北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院吳楠教授、格拉斯哥大學(xué)Jonathan M. Cooper教授、北京機(jī)械設(shè)備研究所楊明珠研究員等合作，報(bào)道了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）捕獲、原位培養(yǎng)和基因分析芯片系統(tǒng)，命名為“NICHE”。NICHE系統(tǒng)從PD-L1基因表達(dá)、腫瘤細(xì)胞響應(yīng)免疫細(xì)胞的行為表型，對(duì)患者來源的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行劃分，實(shí)現(xiàn)了肺癌患者對(duì)免疫療法的精準(zhǔn)預(yù)測(cè)，臨床準(zhǔn)確率（AUC值）達(dá)到90%以上。成果以“Genetic and phenotypic profiling of single living circulating tumor cells from patients with microfluidics”為題，發(fā)表在《PNAS》期刊上。該論文第一作者為北航醫(yī)學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院董再再（助理教授）、北航生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院汪于森碩士、北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院劉冰博士、上海市感染和免疫疾病科技創(chuàng)新中心徐高連教授。

圖1. 循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）捕獲、原位培養(yǎng)和基因分析芯片系統(tǒng)NICHE，用于肺癌免疫治療的精準(zhǔn)預(yù)測(cè)與監(jiān)測(cè)。

該納米細(xì)胞芯片采用磁場(chǎng)和細(xì)胞尺寸，高效去除（> 93%）血樣中的白細(xì)胞，并捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞使其形成單細(xì)胞陣列（>95%）。為了實(shí)現(xiàn)活循環(huán)腫瘤細(xì)胞內(nèi)PD-L1基因的準(zhǔn)確檢測(cè)，研究者們?cè)O(shè)計(jì)了一種具有四面體結(jié)構(gòu)的探針（DNAT），該探針的三條邊上的識(shí)別序列分別用于識(shí)別3種不同的mRNA，通過不同的熒光標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了PD-L1基因、內(nèi)參GAPDH基因，以及循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定基因的同時(shí)檢測(cè)。DNAT探針具有良好的特異性，且能長(zhǎng)時(shí)間抵抗核酸酶的降解。利用納米電穿孔技術(shù)，該探針能在2秒內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)95%以上細(xì)胞的遞送，且細(xì)胞保持良好的活性（90%），與其他常規(guī)方法相比，納米電穿孔技術(shù)展示出更高的遞送性能（圖2）。

圖2. 在單個(gè)活細(xì)胞水平循環(huán)腫瘤細(xì)胞內(nèi)PD-L1 mRNA的精準(zhǔn)量化。

基因檢測(cè)始終，循環(huán)腫瘤細(xì)胞保持良好的活性。通過與免疫T細(xì)胞的共培養(yǎng)，研究者們發(fā)現(xiàn)，部分腫瘤細(xì)胞在免疫抑制劑存在時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變長(zhǎng)，且細(xì)胞增殖行為被顯著抑制（圖3）。根據(jù)腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)情況，研究者們劃分出了PD-L1高表達(dá)與低表達(dá)的閾值；另外，根據(jù)腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)的結(jié)果，研究者們劃分出了腫瘤細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化的閾值。綜合循環(huán)腫瘤細(xì)胞中PD-L1高表達(dá)（PD-L1high）且表型發(fā)生變化（PA+）的占比，該研究定義了一種新的指標(biāo)，“NICHE指數(shù)”，用于預(yù)測(cè)癌癥患者響應(yīng)免疫療法的療效。

圖3. 循環(huán)腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)下發(fā)生形態(tài)改變。

為了評(píng)估NICHE在臨床上預(yù)測(cè)免疫療效的性能，該研究收集了80名非小細(xì)胞肺癌患者的外周血，通過在NICHE平臺(tái)上的檢測(cè)，證明了該平臺(tái)捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞 并鑒定其基因和行為表型的能力（圖4）。從方法對(duì)比結(jié)果來看，該研究提出的NICHE指數(shù)表現(xiàn)出高準(zhǔn)確性，其AUC（0.906）明顯高于目前臨床上基于腫瘤組織中PD-L1表達(dá)細(xì)胞占比的標(biāo)準(zhǔn)參考方法（AUC=0.578）。此外，研究者們還對(duì)部分患者進(jìn)行了長(zhǎng)時(shí)間的用藥監(jiān)測(cè)，證實(shí)了NICHE在長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)中的適用性。

圖4. 采用NICHE系統(tǒng)對(duì)肺癌血樣中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行捕獲與分析，并實(shí)現(xiàn)了患者免疫治療的精準(zhǔn)預(yù)測(cè)。

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https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2315168121