單光子雪崩探測器SPAD助力激光掃描顯微鏡發(fā)展

據麥姆斯咨詢介紹，單光子雪崩探測器（SPAD）是指工作電壓高于擊穿電壓的APD，也稱為蓋革模式APD，通過配套淬滅電路和讀出電路對雪崩倍增過程進行淬滅和恢復控制從而實現單光子探測。由于快速、緊湊的SPAD陣列探測器的引入，激光掃描顯微鏡領域正在經歷快速發(fā)展。

SPAD探測器因其卓越的可靠性、穩(wěn)健性、易于使用和高探測效率而在顯微鏡應用領域中獲得了青睞。異步讀出SPAD陣列探測器經過優(yōu)化，可以顯著增強熒光激光掃描顯微鏡（LSM）的能力。這些專用探測器提供獨特的單光子時空信息，為溫和、定量的超分辨率成像開辟了新的可能性。

SPAD陣列需要搭配讀出電路（ROIC）使用，以實現雪崩信號的提取和處理，同時根據應用需求來選用光子計數、光子計時等功能電路。將SPAD和電子器件集成在同一顆芯片上使得SPAD陣列探測器能夠加速發(fā)展。人們提出了各種設計策略來滿足特定應用的要求。

512 x 512像素SPAD陣列探測器

初始階段涉及一個簡單的SPAD像素陣列，每個像素都包含SPAD及其前端電路。后續(xù)階段涉及將處理電路集成到像素中以執(zhí)行特定功能，從而促進每個SPAD像素的并行和獨立工作。在每個像素內合并多個SPAD及其前端電路也可以抵消固有SPAD死區(qū)時間的影響并增強光子數分辨率。

熒光成像是材料分析的有效工具，特別是在生物應用中，其中許多生物分子在照射時會顯示出自發(fā)熒光。與傳統(tǒng)的熒光成像相比，熒光壽命成像顯微鏡（FLIM）采用時間分辨檢測系統(tǒng)來捕獲特征熒光壽命，而不是僅僅關注發(fā)射光的強度或光譜。

在掃描顯微鏡領域，實現必要時間分辨率的最穩(wěn)健和最有效的方法之一是使用SPAD。

在Optics Express期刊上發(fā)表的“Handheld wide-field fluorescence lifetime imaging system based on a distally mounted SPAD array”論文中，研究人員展示了一種手持式熒光壽命成像顯微鏡系統(tǒng)，采用遠端安裝的“Endocam”SPAD陣列探測器，占用面積不到2平方毫米，分辨率為128 × 120像素，通過長度超過1米的有線接口運行。對于基準測量，研究人員通過市售的Horiba FLIMera時間相關單光子計數（TCSPC）相機來獲取準確的熒光壽命信息。

手持式熒光壽命成像顯微鏡模塊及系統(tǒng)

研究人員展示了使用手持式熒光壽命成像顯微鏡系統(tǒng)拍攝的綿羊腎臟的清晰圖像。該圖像聚焦于羊腎樣本中不同組織成分區(qū)域。在熒光強度圖像中，沒有跡象表明該區(qū)域的組織在成分上與器官的其它部分不同。在FLIM圖像中，則表現出顯著的對比度，熒光壽命范圍從大約1.2 ns到大約2 ns。熒光強度水平非常相似的區(qū)域在熒光壽命上表現出明顯的差異。

“Endocam”SPAD陣列探測器能夠以超過1 Hz的頻率提供FLIM圖像，同時在距控制板約1米的距離處工作，這是一項重大的成就，標志著SPAD陣列探測器首次以這種方式運行，證實了便攜式成像系統(tǒng)可以有效地用于生物工程和其它領域。

根據Optics Express期刊上發(fā)表的“Challenges and prospects for multi-chip microlens imprints on front-side illuminated SPAD imagers”論文顯示，大多數前照式（FSI）SPAD陣列探測器仍然表現出相對較低的填充因子——通常低于50%。這種限制導致光子探測效率（PDE）受到影響。

在光子有限的情況下，特別是在生物光子學中，這可能會帶來挑戰(zhàn)。一些研究采用了獨特的光學系統(tǒng)，其中SPAD探測器充當特殊類型的共聚焦針孔，使光線能夠直接聚焦在感光區(qū)域上。然而，此類設置是例外而不是常態(tài)，并且通常涉及開發(fā)和維護具有挑戰(zhàn)性的設計。

熒光壽命成像（FLI）是一種基于從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的衰變時間來表征分子的成像技術。時間相關單光子計數（TCSPC）由于其在時間分辨率、動態(tài)范圍和魯棒性方面優(yōu)于其它技術，在熒光壽命成像系統(tǒng)中越來越受歡迎。在過去的十年里，SPAD陣列探測器已經成功地應用于TCSPC系統(tǒng)中。然而，當前的熒光壽命成像系統(tǒng)在處理速度和精度方面仍具有局限性。

神經網絡為快速提取熒光壽命提供了一種新的途徑。在Scientific Reports期刊上發(fā)表的“Coupling a recurrent neural network to SPAD TCSPC systems for real-time fluorescence lifetime imaging”論文中，科研人員將遞歸神經網絡（RNN）集成到SPAD-TCSPC系統(tǒng)中，用于實時熒光壽命成像。

與依賴直方圖作為輸入的傳統(tǒng)深度學習方法不同，上述開創(chuàng)性研究僅在數據采集后即可用，RNN消除了直方圖，并以事件驅動的方式處理原始時間戳。這種方法有助于對每個入射光子的壽命估計進行增量和連續(xù)更新，從而實現熒光壽命的實時或即時采集后讀數。這種創(chuàng)新的方法消除了存儲或傳輸時間戳數據或直方圖的需要，顯著減輕了硬件內存和數據傳輸要求的負擔。

熒光共聚焦激光掃描顯微鏡是生命科學研究中應用最廣泛的工具之一。SPAD陣列探測器的出現預計將進一步推動激光掃描顯微鏡的日益普及。與傳統(tǒng)的激光掃描顯微鏡單點探測器相比，SPAD陣列探測器保留了入射熒光光子的空間分布。與科學相機不同，每個陣列像素都作為一個完全獨立的SPAD運行，確保了高的時間精度。將現代數據采集（DAQ）系統(tǒng)與SPAD陣列探測器集成，可以實現高效、快速的光子分辨發(fā)射測量。

近期在Advanced Photonics期刊上發(fā)表的“Compact and effective photon-resolved image scanning microscope”論文中，研究人員成功地將一種新的基于數字頻域（DFD）的DAQ和控制系統(tǒng)集成到單光子激光掃描顯微鏡（SP-LSM）中，并結合了商用的SPAD陣列探測器。該技術利用超分辨率顯微鏡（FLISM）實現了熒光壽命成像。

研究人員使用自適應像素重新分配（APR）從原始數據中重建超分辨率圖像。與傳統(tǒng)的共聚焦激光掃描顯微鏡相比，超分辨率顯微鏡顯示出優(yōu)越的性能，在捕獲的圖像中顯示出更好的分辨率。

上述論文中的研究表明，激光掃描顯微鏡的未來與SPAD陣列探測器之間有著密切的聯系。將SPAD陣列探測器與定制采集系統(tǒng)集成，簡化了對光子分辨成像光譜顯微鏡的數據訪問和使用。

審核編輯：劉清