高通量測序技術(shù)及原理介紹

高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing）又稱“下一代”測序技術(shù)（“Next-generation” sequencing technology），以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標(biāo)志。

高通量測序技術(shù)應(yīng)用

測序技術(shù)推進科學(xué)研究的發(fā)展。隨著第二代測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，科學(xué)界也開始越來越多地應(yīng)用第二代測序技術(shù)來解決生物學(xué)問題。比如在基因組水平上對還沒有參考序列的物種進行從頭測序（de novo sequencing），獲得該物種的參考序列，為后續(xù)研究和分子育種奠定基礎(chǔ)；對有參考序列的物種，進行全基因組重測序（resequencing），在全基因組水平上掃描并檢測突變位點，發(fā)現(xiàn)個體差異的分子基礎(chǔ)。在轉(zhuǎn)錄組水平上進行全轉(zhuǎn)錄組測序（whole transcriptome resequencing），從而開展可變剪接、編碼序列單核苷酸多態(tài)性（cSNP）等研究；或者進行小分子RNA測序（small RNA sequencing），通過分離特定大小的RNA分子進行測序，從而發(fā)現(xiàn)新的microRNA分子。在轉(zhuǎn)錄組水平上，與染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技術(shù)相結(jié)合，從而檢測出與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA區(qū)域和基因組上的甲基化位點。

這邊需要特別指出的是第二代測序結(jié)合微陣列技術(shù)而衍生出來的應(yīng)用--目標(biāo)序列捕獲測序技術(shù)（Targeted Resequencing）。這項技術(shù)首先利用微陣列技術(shù)合成大量寡核苷酸探針，這些寡核苷酸探針能夠與基因組上的特定區(qū)域互補結(jié)合，從而富集到特定區(qū)段，然后用第二代測序技術(shù)對這些區(qū)段進行測序。目前提供序列捕獲的廠家有Agilent和Nimblegen ，應(yīng)用最多的是人全外顯子組捕獲測序。科學(xué)家們目前認為外顯子組測序比全基因組重測序更有優(yōu)勢，不僅僅是費用較低，更是因為外顯子組測序的數(shù)據(jù)分析計算量較小，與生物學(xué)表型結(jié)合更為直接。

目前，高通量測序開始廣泛應(yīng)用于尋找疾病的候選基因上。內(nèi)梅亨大學(xué)的研究人員使用這種方法鑒定出Schinzel-Giedion 綜合征中的致病突變，Schinzel-Giedion綜合征是一種導(dǎo)致嚴重的智力缺陷、腫瘤高發(fā)以及多種先天性畸形的罕見病。他們使用Agilent SureSelect序列捕獲和SOLiD對四位患者的外顯子組進行測序，平均覆蓋度為43倍，讀長為50 nt，每個個體產(chǎn)生了2.7-3 GB可作圖的序列數(shù)據(jù)。他們聚焦于全部四位患者都攜帶變異體的12個基因，最終將候選基因縮小至1個。而貝勒醫(yī)學(xué)院基因組測序中心也計劃對15種以Science雜志年度十大科學(xué)突破上疾病進行研究，包括腦癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、膀胱癌、心臟病、糖尿病、自閉癥以及其他遺傳疾病，以更好地理解致病突變以及突變對疾病的影響。前不久剛剛結(jié)束的評選中，外顯子組測序名列其中。

以上我們盤點了2010年第二代測序技術(shù)的最新進展和相關(guān)應(yīng)用。但是除了第二代測序之外，還有另外一種以單分子實時測序和納米孔為標(biāo)志的第三代測序技術(shù)也正在如火如荼的發(fā)展中，只是還沒有正式發(fā)布。所以目前科學(xué)界所說的高通量測序還指的是第二代測序。

一、測序技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

根據(jù)發(fā)展歷史、影響力、測序原理和技術(shù)不同等，主要有以下幾種：大規(guī)模平行簽名測序（MassivelyParallel Signature Sequencing， MPSS）、聚合酶克?。≒olony Sequencing）、454焦磷酸測序（454 pyrosequencing）、Illumina（Solexa）sequencing、ABI SOLiD sequencing、離子半導(dǎo)體測序（Ion semiconductor sequencing）、DNA納米球測序 （DNA nanoballsequencing）等。

隨著第二代測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，科學(xué)界也開始越來越多地應(yīng)用第二代測序技術(shù)來解決生物學(xué)問題。比如在基因組水平上對還沒有參考序列的物種進行重頭測序（de novosequencing），獲得該物種的參考序列，為后續(xù)研究和分子育種奠定基礎(chǔ);對有參考序列的物種，進行全基因組重測序（resequencing），在全基因組水平上掃描并檢測突變位點，發(fā)現(xiàn)個體差異的分子基礎(chǔ)。在轉(zhuǎn)錄組水平上進行全轉(zhuǎn)錄組測序（wholetranscriptome resequencing），從而開展可變剪接、編碼序列單核苷酸多態(tài)性（cSNP）等研究;或者進行小分子RNA測序（small RNAsequencing），通過分離特定大小的RNA分子進行測序，從而發(fā)現(xiàn)新的microRNA分子。在轉(zhuǎn)錄組水平上，與染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技術(shù)相結(jié)合，從而檢測出與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA區(qū)域和基因組上的甲基化位點。

二、高通量測序技術(shù)的應(yīng)用

測序技術(shù)推進科學(xué)研究的發(fā)展。隨著第二代測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，科學(xué)界也開始越來越多地應(yīng)用第二代測序技術(shù)來解決生物學(xué)問題。比如在基因組水平上對還沒有參考序列的物種進行重頭測序（de novosequencing），獲得該物種的參考序列，為后續(xù)研究和分子育種奠定基礎(chǔ);對有參考序列的物種，進行全基因組重測序（resequencing），在全基因組水平上掃描并檢測突變位點，發(fā)現(xiàn)個體差異的分子基礎(chǔ)。在轉(zhuǎn)錄組水平上進行全轉(zhuǎn)錄組測序（whole transcriptomeresequencing），從而開展可變剪接、編碼序列單核苷酸多態(tài)性（cSNP）等研究;或者進行小分子RNA測序（small RNA sequencing），通過分離特定大小的RNA分子進行測序，從而發(fā)現(xiàn)新的microRNA分子。在轉(zhuǎn)錄組水平上，與染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技術(shù)相結(jié)合，從而檢測出與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA區(qū)域和基因組上的甲基化位點。

需要特別指出的是第二代測序結(jié)合微陣列技術(shù)而衍生出來的應(yīng)用--目標(biāo)序列捕獲測序技術(shù)（Targeted Resequencing）。這項技術(shù)首先利用微陣列技術(shù)合成大量寡核苷酸探針，這些寡核苷酸探針能夠與基因組上的特定區(qū)域互補結(jié)合，從而富集到特定區(qū)段，然后用第二代測序技術(shù)對這些區(qū)段進行測序。目前提供序列捕獲的廠家有Agilent和Nimblegen，應(yīng)用最多的是人全外顯子組捕獲測序?？茖W(xué)家們目前認為外顯子組測序比全基因組重測序更有優(yōu)勢，不僅僅是費用較低，更是因為外顯子組測序的數(shù)據(jù)分析計算量較小，與生物學(xué)表型結(jié)合更為直接。

目前，高通量測序開始廣泛應(yīng)用于尋找疾病的候選基因上。內(nèi)梅亨大學(xué)的研究人員使用這種方法鑒定出Schinzel-Giedion 綜合征中的致病突變，Schinzel-Giedion綜合征是一種導(dǎo)致嚴重的智力缺陷、腫瘤高發(fā)以及多種先天性畸形的罕見病。他們使用AgilentSureSelect序列捕獲和SOLiD對四位患者的外顯子組進行測序，平均覆蓋度為43倍，讀長為50 nt，每個個體產(chǎn)生了2.7-3GB可作圖的序列數(shù)據(jù)。他們聚焦于全部四位患者都攜帶變異體的12個基因，最終將候選基因縮小至1個。而貝勒醫(yī)學(xué)院基因組測序中心也計劃對15種以上疾病進行研究，包括腦癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、膀胱癌、心臟病、糖尿病、自閉癥以及其他遺傳疾病，以更好地理解致病突變以及突變對疾病的影響。前不久剛剛結(jié)束的Science雜志年度十大科學(xué)突破評選中，外顯子組測序名列其中。

三、測序技術(shù)總結(jié)與展望

第一代測序技術(shù)憑借其長的序列片段和高的準(zhǔn)確率，適合對新物種進行基因組長距框架的搭建以及后期GAP填補，但是成本昂貴，而且難以勝任微量DNA樣品的測序工作。第二代測序技術(shù)中，454序列片段最長，比較適合對未知基因組從頭測序，搭建主體結(jié)構(gòu)，但是在判斷連續(xù)單堿基重復(fù)區(qū)時準(zhǔn)確度不高。Solexa較454具有通量高、片段短、價位低的特點，可以用于大基因組和小基因組的測序和重測序。Solexa雙末端測序（paired-end sequencing）可以為基因組進一步拼接提供定位信息，但是隨著反應(yīng)輪數(shù)增加，序列長度和質(zhì)量均有所下降，而且在閱讀AT區(qū)時有明顯錯誤傾向。SOLiD基于雙堿基編碼系統(tǒng)的糾錯能力以及較高的測序通量，適合轉(zhuǎn)錄本研究以及比較基因組學(xué)特別是SNP檢測等，但是測序的片段短限制了該技術(shù)在基因組拼接中的廣泛應(yīng)用。第三代測序技術(shù)目前正在研發(fā)階段，尚未正式投入使用。