了解一下分子診斷技術(shù)近50年的發(fā)展歷程

分子診斷技術(shù)是指以DNA和RNA為診斷材料，用分子生物學(xué)技術(shù)通過(guò)檢測(cè)基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，從而對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的技術(shù)。其基本原理是檢測(cè)DNA或RNA的結(jié)構(gòu)是否變化、量的多少及表達(dá)功能是否異常，以確定受檢者有無(wú)基因水平的異常變化，對(duì)疾病的預(yù)防、預(yù)測(cè)、診斷、治療和預(yù)后具有重要意義。通俗簡(jiǎn)單的講所有基于分子生物學(xué)水平的方法學(xué)技術(shù)都屬于分子診斷技術(shù)，比如PCR技術(shù)、基因測(cè)序技術(shù)等等。

PCR技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，基本原理類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性，模板DNA與引物的退火(復(fù)性)，引物的延伸。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。由1983年美國(guó)Mullis首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡(jiǎn)易DNA擴(kuò)增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。簡(jiǎn)單講PCR技術(shù)本質(zhì)上是針對(duì)DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增放大，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)使得樣本中DNA含量可以檢測(cè)出來(lái)。

基因測(cè)序技術(shù)即測(cè)定DNA序列的技術(shù)。在分子生物學(xué)研究中，DNA的序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。目前用于測(cè)序的技術(shù)主要有Sanger等（1977）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法和 Maxam和 Gilbert（1977）發(fā)明的化學(xué)降解法。這二種方法在原理上差異很大，但都是根據(jù)核苷酸在某一固定的點(diǎn)開(kāi)始，隨機(jī)在某一個(gè)特定的堿基處終止，產(chǎn)生 A，T，C，G四組不同長(zhǎng)度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測(cè)，從而獲得DNA序列。目前 Sanger測(cè)序法得到了廣泛的應(yīng)用。簡(jiǎn)單講基因測(cè)序技術(shù)是針對(duì)DNA片段進(jìn)行測(cè)序和分析，使得DNA序列得以清晰。

下面一起來(lái)了解一下分子診斷技術(shù)近50年的發(fā)展歷程：

一、基于分子雜交的分子診斷技術(shù)

上世紀(jì)60年代至80年代是分子雜交技術(shù)發(fā)展最為迅猛的20年,由于當(dāng)時(shí)尚無(wú)法對(duì)樣本中靶基因進(jìn)行人為擴(kuò)增,人們只能通過(guò)已知基因序列的探針對(duì)靶序列進(jìn)行捕獲檢測(cè)。其中液相和固相雜交基礎(chǔ)理論、探針固定包被技術(shù)與cDNA探針人工合成的出現(xiàn),為基于分子雜交的體外診斷方法進(jìn)行了最初的技術(shù)儲(chǔ)備。

(一)DNA印跡技術(shù)(Southern blot)

Southern[1]于1975年發(fā)明了DNA印跡技術(shù),通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶將DNA片段化,再以凝膠電泳將長(zhǎng)度不等的DNA片段進(jìn)行分離,通過(guò)虹吸或電壓轉(zhuǎn)印至醋酸纖維膜上,再使膜上的DNA變性與核素標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行分子雜交,經(jīng)洗脫后以放射自顯影鑒別待測(cè)的DNA片段-探針間的同源序列。這一方法由于同時(shí)具備DNA片段酶切與分子探針雜交,保證了檢測(cè)的特異性。因此,一經(jīng)推出后便成為探針雜交領(lǐng)域最為經(jīng)典的分子檢測(cè)方法,廣為運(yùn)用于各種基因突變,如缺失、插入、易位等,及與限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)的鑒定中。Alwine等[2]于1977年推出基于轉(zhuǎn)印雜交的Northern blot技術(shù)也同樣成為當(dāng)時(shí)檢測(cè)RNA的金標(biāo)準(zhǔn)。

(二)ASO反向斑點(diǎn)雜交(allele-specific oligonucleotide reverse dot blot,ASO-RDB)

使用核酸印跡技術(shù)進(jìn)行核酸序列的雜交檢測(cè)具有極高的特異性,但存在操作極為繁瑣,檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)。1980年建立的樣本斑點(diǎn)點(diǎn)樣固定技術(shù)則擺脫了傳統(tǒng)DNA印跡需要通過(guò)凝膠分離技術(shù)進(jìn)行樣本固定的缺點(diǎn)。通過(guò)在質(zhì)粒載體導(dǎo)入單堿基突變的方法,構(gòu)建了首條等位基因特異性寡核苷酸探針(allele-specific oligonucleotide,ASO),更使對(duì)核酸序列點(diǎn)突變的檢測(cè)成為可能。1986年,Saiki[3]首次將PCR的高靈敏度與ASO斑點(diǎn)雜交的高特異性結(jié)合起來(lái),實(shí)現(xiàn)了利用ASO探針對(duì)特定基因多態(tài)性進(jìn)行分型。其后為了完成對(duì)同一樣本的多個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行高通量檢測(cè),Saiki[4]又發(fā)明了ASO-RDB,通過(guò)將生物素標(biāo)記的特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與固定于膜上的探針雜交顯色,進(jìn)行基因分型、基因突變的檢測(cè)。該法可將多種寡核苷酸探針固定于同一膜條上,只需通過(guò)1次雜交反應(yīng),即可篩查待檢樣本DNA的數(shù)十乃至數(shù)百種等位基因,具有操作簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn),一度成為基因突變檢測(cè)、基因分型與病原體篩選最為常用的技術(shù)。

(三)熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)

FISH源于以核素標(biāo)記的原位雜交技術(shù),1977年Rudkin[5]首次使用熒光素標(biāo)記探針完成了原位雜交的嘗試。在上世紀(jì)8090年代,細(xì)胞遺傳學(xué)和非同位素標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展將FISH推向臨床診斷的實(shí)踐應(yīng)用。相比于其它僅針對(duì)核酸序列進(jìn)行檢測(cè)的分子診斷技術(shù),FISH結(jié)合了探針的高度特異性與組織學(xué)定位的優(yōu)勢(shì),可檢測(cè)定位完整細(xì)胞或經(jīng)分離的染色體中特定的正?；虍惓NA序列;由于使用高能量熒光素標(biāo)記的DNA探針,可實(shí)現(xiàn)多種熒光素標(biāo)記同時(shí)檢測(cè)數(shù)個(gè)靶點(diǎn)。

如今,FISH已在染色體核型分析,基因擴(kuò)增、 基因重排、病原微生物鑒定等多方面中得到廣泛應(yīng)用。通過(guò)比較基因組雜交(comparative genomic hybridization,CGH)與光譜核型分析(spectral karyotyping,SKY)等FISH衍生技術(shù),使其正在越來(lái)越多的臨床診斷領(lǐng)域中發(fā)揮作用。

(四)多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA)

MLPA技術(shù)于2002年由Schouten等[6]首先報(bào)道。每個(gè)MLPA探針包括2個(gè)熒光標(biāo)記的寡核苷酸片段,1個(gè)由化學(xué)合成,1個(gè)由M13噬菌體衍生法制備;每個(gè)探針都包括1段引物序列和1段特異性序列。在MLPA反應(yīng)中,2個(gè)寡核苷酸片段都與靶序列進(jìn)行雜交,再使用連接酶連接2部分探針。連接反應(yīng)高度特異,只有當(dāng)2個(gè)探針與靶序列完全雜交,連接酶才能將2段探針連接成1條完整的核酸單鏈;反之,如果靶序列與探針序列不完全互補(bǔ),即使只有1個(gè)堿基的差別,就會(huì)導(dǎo)至雜交不完全,使連接反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行。連接反應(yīng)完成后,用1對(duì)熒光標(biāo)記的通用引物擴(kuò)增連接好的探針,每個(gè)探針擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度都是唯一的。最后,通過(guò)毛細(xì)管電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物,便可對(duì)把核酸序列進(jìn)行檢測(cè)。由于巧妙地借鑒了擴(kuò)增探針的原理,MLPA技術(shù)最多可在1次反應(yīng)中對(duì)45個(gè)靶序列的拷貝數(shù)進(jìn)行鑒定。

該技術(shù)具備探針連接反應(yīng)的特異性與多重?cái)U(kuò)增探針雜交的高通量特性。經(jīng)過(guò)MRC-Holland公司10余年的發(fā)展,MLPA技術(shù)已成為涵蓋各種遺傳性疾病診斷、藥物基因?qū)W多遺傳位點(diǎn)鑒定、腫瘤相關(guān)基因突變譜篩查、DNA甲基化程度定量等綜合分子診斷體系,是目前臨床最為常用的高通量對(duì)已知序列變異、基因拷貝數(shù)變異進(jìn)行檢測(cè)的方法。

(五)生物芯片

1991年Affymetrix公司的Fordor[7]利用其所研發(fā)的光蝕刻技術(shù)制備了首個(gè)以玻片為載體的微陣列,標(biāo)志著生物芯片正式成為可實(shí)際應(yīng)用的分子生物學(xué)技術(shù)。時(shí)至今日,芯片技術(shù)已經(jīng)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展,如果按結(jié)構(gòu)對(duì)其進(jìn)行分類(lèi),基本可分為基于微陣列(microarray)的雜交芯片與基于微流控(microfluidic)的反應(yīng)芯片2種。

1.微陣列芯片

(1)固相芯片:微陣列基因組DNA分析(microarray-based genomic DNA profiling,MGDP)芯片:將微陣列技術(shù)應(yīng)用于MGDP檢測(cè)中已有超過(guò)十年的歷史,其技術(shù)平臺(tái)主要分為2類(lèi),即微陣列比較基因組雜交(array-based comparative genome hybridization,aCGH)和基因型雜交陣列(SNP array)。顧名思義,aCGH芯片使用待測(cè)DNA與參比DNA的雙色比對(duì)來(lái)顯示兩者間的拷貝數(shù)變異(CNV)的變化,而單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片則無(wú)需與參比DNA進(jìn)行比較,直接通過(guò)雜交信號(hào)強(qiáng)度顯示待測(cè)DNA中的SNP信息。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步,目前市場(chǎng)上已出現(xiàn)可同時(shí)檢測(cè)SNP與CNV的高分辨率混合基因陣列芯片。MGDP芯片主要應(yīng)用于發(fā)育遲緩、先天性異?；蔚葍和z傳病的輔助診斷及產(chǎn)前篩查。經(jīng)驗(yàn)證,使用MGDP芯片進(jìn)行染色體不平衡檢測(cè)與FISH的診斷符合率可達(dá)100%[8],表達(dá)譜芯片(gene expression profiling array,GEP array):1999年,Duggan等[9]首次使用cDNA芯片繪制了mRNA表達(dá)譜信息。隨著表觀遺傳學(xué)在疾病發(fā)生發(fā)展中的作用日益得到重視,目前也已出現(xiàn)microRNA芯片、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)芯片等。類(lèi)似于MGDP芯片,GEP芯片使用反轉(zhuǎn)錄后生成的cDNA文庫(kù)與固定于芯片載體上的核酸探針進(jìn)行雜交,從而檢測(cè)雜交熒光信號(hào)的強(qiáng)度判斷基因的表達(dá)情況。相較于基因組雜交,GEP芯片對(duì)生物學(xué)意義更為重要的轉(zhuǎn)錄組信息進(jìn)行檢測(cè),對(duì)疾病的診斷與預(yù)后判斷具有特殊的意義。目前使用GEP芯片對(duì)急性髓細(xì)胞白血病、骨髓增生異常綜合征等血液病及神經(jīng)退行性變等進(jìn)行診斷、分類(lèi)及預(yù)后評(píng)估已經(jīng)獲得了令人滿意的效果;

(2)液相芯片:傳統(tǒng)固相芯片將檢測(cè)探針錨定于固相載體上捕獲目的序列,而Luminex公司的xMAP技術(shù)[10]則通過(guò)搭配不同比例的2種紅色熒光染料,將聚苯乙烯微球標(biāo)記為不同的熒光色,并對(duì)其進(jìn)行編碼得到具有上百種熒光編號(hào)的微球。通過(guò)xTAG技術(shù)將不同的特異性雜交探針交聯(lián)至編碼微球上,使得不同的探針能夠通過(guò)微球編碼得以區(qū)分。利用混合后的探針-微球復(fù)合物與待測(cè)樣本進(jìn)行雜交,使微球在流動(dòng)鞘液的帶動(dòng)下通過(guò)紅綠雙色流式細(xì)胞儀,其中紅色激光檢測(cè)微球編碼,綠色熒光檢測(cè)經(jīng)雜交后核酸探針上熒光報(bào)告基團(tuán)的信號(hào)強(qiáng)度,一次完成對(duì)單個(gè)樣本中多種靶序列的同時(shí)鑒定。目前,該技術(shù)已在囊性纖維化等遺傳性疾病診斷、多種呼吸道病毒鑒定及人乳頭瘤病毒分型取得了廣泛的應(yīng)用。

2.微流控芯片

1992年Harrison等[11]首次提出了將毛細(xì)管電泳與進(jìn)樣設(shè)備整合到固相玻璃載體上構(gòu)建“微全分析系統(tǒng)”的構(gòu)想,通過(guò)分析設(shè)備的微型化與集成化,完成傳統(tǒng)分析實(shí)驗(yàn)室向芯片上實(shí)驗(yàn)室(lab-on-chip)的轉(zhuǎn)變。微流控芯片(microfluidic chip)由微米級(jí)流體的管道、反應(yīng)器等元件構(gòu)成,與宏觀尺寸的分析裝置相比,其結(jié)構(gòu)極大地增加了流體環(huán)境的面積/體積比,以最大限度利用液體與物體表面有關(guān)的包括層流效應(yīng)、毛細(xì)效應(yīng)、快速熱傳導(dǎo)和擴(kuò)散效應(yīng)在內(nèi)的特殊性能,從而在1張芯片上完成樣品進(jìn)樣、預(yù)處理、分子生物學(xué)反應(yīng)、檢測(cè)等系列實(shí)驗(yàn)過(guò)程。

目前使用微流控芯片進(jìn)行指導(dǎo)用藥的多基因位點(diǎn)平行檢測(cè)是主要臨床應(yīng)用領(lǐng)域。

二、核酸序列測(cè)定

測(cè)序反應(yīng)是直接獲得核酸序列信息的唯一技術(shù)手段,是分子診斷技術(shù)的一項(xiàng)重要分支。雖然分子雜交、分子構(gòu)象變異或定量PCR技術(shù)在近幾年已得到了長(zhǎng)足的發(fā)展,但其對(duì)于核酸的鑒定都僅僅停留在間接推斷的假設(shè)上,因此對(duì)基于特定基因序列檢測(cè)的分子診斷,核酸測(cè)序仍是技術(shù)上的金標(biāo)準(zhǔn)。

(一)第1代測(cè)序

1975年Sanger與Coulson發(fā)表了使用加減法進(jìn)行DNA序列測(cè)定的方法,隨后Maxam在1977年提出了化學(xué)修飾降解法的模型,為核酸測(cè)序時(shí)代的來(lái)臨拉開(kāi)了序幕。

Sanger等于同年提出的末端終止法(Sanger測(cè)序法)利用2'與3'不含羥基的雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)進(jìn)行測(cè)序引物延伸反應(yīng),ddNTP在DNA合成反應(yīng)中不能形成磷酸二酯鍵,DNA合成反應(yīng)便會(huì)終止。如果分別在4個(gè)獨(dú)立的DNA合成反應(yīng)體系中加入經(jīng)核素標(biāo)記的特定ddNTP,則可在合成反應(yīng)后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)及放射自顯影,根據(jù)電泳條帶確定待測(cè)分子的核苷酸序列。Appied Biosystems公司在Sanger法的基礎(chǔ)上,于1986年推出了首臺(tái)商業(yè)化DNA測(cè)序儀PRISM 370A,并以熒光信號(hào)接收和計(jì)算機(jī)信號(hào)分析代替了核素標(biāo)記和放射自顯影檢測(cè)體系。該公司于1995年推出的首臺(tái)毛細(xì)管電泳測(cè)序儀PRISM 310更是使測(cè)序的通量大大提高。Sanger測(cè)序是最為經(jīng)典的一代測(cè)序技術(shù),仍是目前獲取核酸序列最為常用的方法。

(二)第2代測(cè)序

1.焦磷酸測(cè)序(Pyro-sequencing)

不同于Sanger測(cè)序法所使用的合成后測(cè)序理念,Ronaghi分別于1996年與1998年提出了在固相[13]與液相[14]載體中通過(guò)邊合成邊測(cè)序的方法-焦磷酸測(cè)序。其基本原理是利用引物鏈延伸時(shí)所釋放的焦磷酸基團(tuán)激發(fā)熒光,通過(guò)峰值高低判斷與其相匹配的堿基數(shù)量。由于使用了實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)的概念,焦磷酸測(cè)序?qū)崿F(xiàn)了對(duì)特定位點(diǎn)堿基負(fù)荷比例的定量,因此在SNP位點(diǎn)檢測(cè)、等位基因(突變)頻率測(cè)定、細(xì)菌和病毒分型檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛。由于熒光報(bào)告原理不同,其對(duì)于序列變異的檢測(cè)靈敏度從Sanger測(cè)序的20%提高到了5%。但由于該技術(shù)的儀器采購(gòu)與單次檢測(cè)成本較高,目前尚未得到大規(guī)模的臨床使用。

2.高通量第2代測(cè)序

目前常見(jiàn)的高通量第二代測(cè)序平臺(tái)主要有Roche 454、Illumina Solexa、ABI SOLiD和Life Ion Torrent等,其均為通過(guò)DNA片段化構(gòu)建DNA文庫(kù)、文庫(kù)與載體交聯(lián)進(jìn)行擴(kuò)增、在載體面上進(jìn)行邊合成邊測(cè)序反應(yīng),使得第1代測(cè)序中最高基于96孔板的平行通量擴(kuò)大至載體上百萬(wàn)級(jí)的平行反應(yīng),完成對(duì)海量數(shù)據(jù)的高通量檢測(cè)。該技術(shù)可以對(duì)基因組、轉(zhuǎn)錄組等進(jìn)行真正的組學(xué)檢測(cè),在指導(dǎo)疾病分子靶向治療、繪制藥物基因組圖譜指導(dǎo)個(gè)體化用藥、感染性疾病的病原微生物宏基因組鑒定及通過(guò)母體中胎兒DNA信息進(jìn)行產(chǎn)前診斷等方面已經(jīng)取得了喜人的成績(jī)。然而,由于該技術(shù)需要對(duì)DNA進(jìn)行片段化處理,測(cè)序反應(yīng)讀長(zhǎng)較短(如Solexa與SOLiD系統(tǒng)單次讀長(zhǎng)僅50bp),需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行大規(guī)模拼接,因此對(duì)分子診斷工作者掌握生物信息學(xué)知識(shí)提出了更高要求,以利于后期的測(cè)序數(shù)據(jù)分析。

(三)第3代測(cè)序

第3代測(cè)序技術(shù)的核心理念是以單分子為目標(biāo)的邊合成邊測(cè)序。該技術(shù)的操作平臺(tái)目前主要有Helicos公司的Heliscope、Pacific Biosciences公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔技術(shù)等。該技術(shù)進(jìn)一步降低了成本,可對(duì)混雜的基因物質(zhì)進(jìn)行單分子檢測(cè),故對(duì)SNP、CNV的鑒定更具功效。但是目前其進(jìn)入產(chǎn)品商業(yè)化,并最終投入臨床應(yīng)用仍有很長(zhǎng)的距離。

三、基于分子構(gòu)象的分子診斷技術(shù)

(一)變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)與單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism,SSCP)

1970~1980年間,Fischer等[15]與Orita等[16]分別提出了利用核酸序列變異所導(dǎo)至雙鏈變性條件差異與單鏈空間折疊差異,通過(guò)變性與非變性PAGE對(duì)變異序列進(jìn)行分離鑒定的方法,即DGGE與SSCP。上述2項(xiàng)技術(shù)均通過(guò)變異核酸分子在空間構(gòu)象上的差異,通過(guò)特定條件下電泳速率的變化進(jìn)行檢測(cè)。正因?yàn)楹怂岱肿訕?gòu)象具有序列特異性,且對(duì)于序列的改變非常敏感,常常1個(gè)堿基的變化也能得到鑒定。但由于DGGE與SSCP均必須進(jìn)行PCR后開(kāi)蓋電泳的操作,現(xiàn)已不常見(jiàn)于臨床檢測(cè)。

(二)變性高效液相色譜(denaturing high-performance liquid chromatography,dHPLC)

1997年,Oefner和Underhill建立[17,18]了利用異源雙鏈變性分離變異序列、使用色譜洗脫鑒定的技術(shù),稱(chēng)為dHPLC,可自動(dòng)檢測(cè)單堿基置換及小片段核苷酸的插入或缺失。對(duì)于存在一定比例變異序列的核酸雙鏈混合物,其經(jīng)過(guò)變性和復(fù)性過(guò)程后,體系內(nèi)將出現(xiàn)2種雙鏈:一種為同源雙鏈,由野生正義鏈-野生反義鏈或變異正義鏈-變異反義鏈構(gòu)成的核酸雙鏈;另一種為異源雙鏈,即雙鏈中1條單鏈為野生型,而另1條為變異型。由于存在部分堿基錯(cuò)配的異源雙鏈 DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特征不同,在相同的部分變性條件下,異源雙鏈因存在錯(cuò)配區(qū)而更易變性,被色譜柱保留的時(shí)間短于同源雙鏈,故先被洗脫下來(lái),從而在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線。由于該技術(shù)使用了較高分析靈敏度的色譜技術(shù)進(jìn)行檢測(cè),可快速檢出<5%負(fù)荷的變異序列。但需注意的是,由于該技術(shù)主要通過(guò)異源雙鏈進(jìn)行序列變異檢測(cè),其不能明顯區(qū)分野生型與變異型的純合子。

(三)高分辨率熔解分析(high-resolution melting analysis,HRMA)

2003年,Wittwer等[19]首次革命性地使用過(guò)飽和熒光染料將PCR產(chǎn)物全長(zhǎng)進(jìn)行熒光被動(dòng)標(biāo)記,再通過(guò)簡(jiǎn)單的產(chǎn)物熔解分析對(duì)單個(gè)堿基變化進(jìn)行鑒定。該技術(shù)的原理也是通過(guò)異源雙鏈進(jìn)行序列變異鑒定。待測(cè)樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增后,若存在序列變異雜合子,則形成異源雙鏈,其熔解溫度大大下降。此時(shí)由于雙鏈被飽和染料完全填充,其產(chǎn)物熔解溫度的變化便可通過(guò)熔解曲線的差異得以判定。對(duì)于變異純合子而言,HRMA也可利用其較高的分辨率完成PCR產(chǎn)物單個(gè)位點(diǎn)A:T雙鍵配對(duì)與G:C三建配對(duì)熱穩(wěn)定性差異的鑒定,但是對(duì)于Ⅱ、Ⅲ類(lèi)SNP的純合子變異則無(wú)法有效區(qū)分。

如何利用DNA構(gòu)象對(duì)序列進(jìn)行推測(cè),從而避免成本較高的序列測(cè)定或操作繁瑣的雜交反應(yīng)一直是分子生物學(xué)研究與應(yīng)用的熱點(diǎn)問(wèn)題。目前,使用構(gòu)象變化對(duì)序列變異進(jìn)行間接檢測(cè)的便捷性已得到一致肯定,尤其是HRMA可完成對(duì)變異序列單次閉管的擴(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)。但需要注意的是,由于基于構(gòu)象變化的分子檢測(cè)手段多無(wú)法通過(guò)探針雜交或核酸序列測(cè)定對(duì)檢測(cè)的特異性進(jìn)行嚴(yán)格的保證,因此其只適合大規(guī)模的初篩,而真正的確診仍需要進(jìn)行雜交或測(cè)序的驗(yàn)證。

四、定量PCR(quantitative PCR,qPCR)

相比于其他分子診斷檢測(cè)技術(shù),qPCR具有2項(xiàng)優(yōu)勢(shì),即核酸擴(kuò)增和檢測(cè)在同一個(gè)封閉體系中通過(guò)熒光信號(hào)進(jìn)行,杜絕了PCR后開(kāi)蓋處理所帶來(lái)擴(kuò)增產(chǎn)物的污染;同時(shí)通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào),可對(duì)低拷貝模板進(jìn)行定量。正是由于上述技術(shù)優(yōu)勢(shì),qPCR已經(jīng)成為目前臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室接受程度最高的技術(shù),在各類(lèi)病毒、細(xì)菌等病原微生物的鑒定和基因定量檢測(cè)、基因多態(tài)性分型、基因突變篩查、基因表達(dá)水平監(jiān)控等多種臨床實(shí)踐中得到大量應(yīng)用。但伴隨著qPCR技術(shù)的迅猛發(fā)展,有關(guān)這項(xiàng)技術(shù)的質(zhì)量管理問(wèn)題也日益突出,如何消除各類(lèi)生物學(xué)變量所引起的檢測(cè)變異,減少或抑制實(shí)驗(yàn)操作與方法學(xué)中的各種干擾因素是qPCR技術(shù)面臨的難題。

(一)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)

1.雙鏈摻入法

1992年Higuchi等[20-21]通過(guò)在PCR反應(yīng)液中摻入溴乙錠對(duì)每個(gè)核酸擴(kuò)增熱循環(huán)后的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定,提出了使用熒光強(qiáng)度與熱循環(huán)數(shù)所繪制的核酸擴(kuò)增曲線,定量反應(yīng)體系中初始模板的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(real-time PCR)模型,開(kāi)創(chuàng)了通過(guò)實(shí)時(shí)閉管檢測(cè)熒光信號(hào)進(jìn)行核酸定量的方法。核酸染料可以嵌入DNA雙鏈,且只有嵌入雙鏈時(shí)才釋放熒光,在每1次的擴(kuò)增循環(huán)后檢測(cè)反應(yīng)管的熒光強(qiáng)度,繪制熒光強(qiáng)度-熱循環(huán)數(shù)的S形核酸擴(kuò)增曲線,以熒光閾值與擴(kuò)增曲線的交點(diǎn)在擴(kuò)增循環(huán)數(shù)軸上的投影作為循環(huán)閾值(Cycle threshold,Ct),則Ct與反應(yīng)體系中所含初始模板數(shù)量呈負(fù)指數(shù)關(guān)系,推斷初始模板量。隨后Morrison[22]提出了使用高靈敏度的雙鏈染料SYBR Green I進(jìn)行反應(yīng)體系中低拷貝模板定量的方法。這一方法操作簡(jiǎn)便,但由于僅使用擴(kuò)增引物的序列啟動(dòng)核酸擴(kuò)增,其產(chǎn)物特異性無(wú)法得到充分保證。雖然在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)后可通過(guò)熔解曲線對(duì)產(chǎn)物特異性進(jìn)行檢驗(yàn),但其特異性明顯遜于使用熒光探針進(jìn)行檢測(cè),因此雙鏈摻入法并未在臨床實(shí)踐中得到認(rèn)可。

2.Taqman探針

由于雙鏈摻入法存在特異性較低的問(wèn)題,1996年Heid[23]綜合之前發(fā)現(xiàn)的Taq酶的5'核酸酶活性與熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探針的概念提出了使用Taqman探針進(jìn)行qPCR的方法。TaqMan探針的本質(zhì)是FRET寡核苷酸探針,在探針的5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán),3'端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán),利用Taq酶具有5'3'外切酶活性,在PCR過(guò)程中水解與靶序列結(jié)合的寡核苷酸探針,使熒光基團(tuán)得以游離,釋放熒光信號(hào)。從而使能夠與靶序列雜交的探針在擴(kuò)增過(guò)程中釋放熒光,通過(guò)real-time PCR的原理對(duì)其進(jìn)行定量。由于其超高的特異性與成功的商品化推廣,Taqman探針已經(jīng)成為目前臨床使用最為廣泛的qPCR方法,其在各種病毒基因定量檢測(cè)、基因分型、腫瘤相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)等方面具有著不可替代的地位。

3.分子信標(biāo)

同樣在1996年,Tyagi等[24] 提出了使用分子信標(biāo)(moleuclar beacons)進(jìn)行qPCR的方法,分子信標(biāo)是5'與3'端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針,其兩端具有互補(bǔ)的高GC序列,在qPCR反應(yīng)液中呈發(fā)夾結(jié)構(gòu),熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而保持靜息狀態(tài)。當(dāng)PCR反應(yīng)開(kāi)始后,莖環(huán)結(jié)構(gòu)在變性高溫條件下打開(kāi),釋放熒光;在退火過(guò)程中,靶序列特異性探針則與模板雜交保持線性,不能與模板雜交的探針則復(fù)性為莖環(huán)結(jié)構(gòu)而熒光淬滅,通過(guò)檢測(cè)qPCR體系中退火時(shí)的熒光信號(hào)強(qiáng)度,便可以real-time PCR原理特異性檢測(cè)體系中的初始模板濃度。相比于Taqman探針,分子信標(biāo)使用發(fā)卡結(jié)構(gòu)使熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)在空間上緊密結(jié)合,大大降低了檢測(cè)的熒光背景,其檢測(cè)特異性較Taqman探針更高,更適合等位基因的分型檢測(cè)。

4.雙雜交探針

1997年,Wittwer等[25]發(fā)表了使用分別標(biāo)記熒光供體基團(tuán)與熒光受體基團(tuán)的2條相鄰寡核苷酸探針進(jìn)行qPCR的方法。雙雜交探針?biāo)鶚?biāo)記的供體基團(tuán)和受體基團(tuán)的激發(fā)光譜間具有一定重疊,且2條探針與靶核酸的雜交位置應(yīng)相互鄰近。僅當(dāng)2條探針與靶基因同時(shí)雜交時(shí),供體與受體基因得以接近,從而通過(guò)FRET發(fā)生能量傳遞,激發(fā)熒光信號(hào),熒光信號(hào)強(qiáng)度與反應(yīng)體系中靶序列DNA含量呈正比。由于使用了2條探針進(jìn)行靶序列雜交,該方法的特異性比傳統(tǒng)單探針檢測(cè)體系得到了極大地提升。

(二)數(shù)字PCR

早在上世紀(jì)90年代就出現(xiàn)了使用微流控陣列對(duì)單次qPCR反應(yīng)進(jìn)行分散檢測(cè)的概念?；谶@一理念,Vgelstein與Kinzter[26]于1999年發(fā)表了數(shù)字PCR(digital PCR)的方法,對(duì)結(jié)腸癌患者糞便中的微量 K-RAS基因突變進(jìn)行了定量。相比于傳統(tǒng)的qPCR方法,數(shù)字PCR的核心是將qPCR反應(yīng)進(jìn)行微球乳糜液化,再將乳糜液分散至芯片的微反應(yīng)孔中,保證每個(gè)反應(yīng)孔中僅存在≤1個(gè)核酸模板。經(jīng)過(guò)PCR后,對(duì)每個(gè)微反應(yīng)孔的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè),存在靶核酸模板的反應(yīng)孔會(huì)釋放熒光信號(hào),沒(méi)有靶模板的反應(yīng)孔就沒(méi)有熒光信號(hào),以此推算出原始溶液中待測(cè)核酸的濃度。因此,數(shù)字PCR是1種檢測(cè)反應(yīng)終點(diǎn)熒光信號(hào)進(jìn)行絕對(duì)定量的qPCR反應(yīng),而非以模板Ct值進(jìn)行核酸定量的real-time PCR。

經(jīng)由Quantalife公司開(kāi)發(fā)(已于2011年被BIO-RAD收購(gòu))的微滴式數(shù)字PCR是首款商品化的數(shù)字PCR檢測(cè)系統(tǒng),目前已被廣泛運(yùn)用于微量病原微生物基因檢測(cè)、低負(fù)荷遺傳序列鑒定、基因拷貝數(shù)變異與單細(xì)胞基因表達(dá)檢測(cè)等多個(gè)臨床前沿領(lǐng)域。與傳統(tǒng)qPCR相比較,該技術(shù)具有超高的靈敏度與精密度,使其成為目前qPCR領(lǐng)域的新星。

五、對(duì)未來(lái)5年的展望

半個(gè)世紀(jì)以來(lái)分子診斷的高速發(fā)展離不開(kāi)分子生物學(xué)技術(shù)日新月異的進(jìn)步。概而言之,在過(guò)去的50年中分子診斷技術(shù)取得了三大轉(zhuǎn)化與3項(xiàng)提升:即報(bào)告信號(hào)檢測(cè)從放射核素標(biāo)記向熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)化,操作方法由手工操作向全自動(dòng)化轉(zhuǎn)化,檢測(cè)分析通量從單一標(biāo)志物向高通量多組學(xué)聯(lián)合判斷轉(zhuǎn)化;檢測(cè)靈敏度、精密度、特異性的快速提升。

在未來(lái)5年中,我國(guó)分子診斷事業(yè)將迎來(lái)兩方面的進(jìn)步。隨著衛(wèi)生監(jiān)管部門(mén)對(duì)分子診斷重要性的認(rèn)識(shí)不斷深入與越來(lái)越多高學(xué)歷、高素質(zhì)人才的進(jìn)入,分子診斷將會(huì)出現(xiàn)理念的革命性進(jìn)步,高通量技術(shù)將更多的進(jìn)入臨床的實(shí)際應(yīng)用中。隨著技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,傳統(tǒng)針對(duì)特定基因異常、病原微生物感染鑒定的方法學(xué),也將在檢測(cè)的各項(xiàng)分析性能與操作便捷程度上取得長(zhǎng)足的進(jìn)步。對(duì)于傳統(tǒng)人力與時(shí)間成本較高的檢測(cè)方法學(xué),將出現(xiàn)兩極分化的態(tài)勢(shì),即Southern等經(jīng)典的檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)將得到保留;而ASO-RDB等靈敏度、特異性均不能滿足實(shí)際臨床需求的方法將快速被新型技術(shù)所取代。最終,分子診斷也必將一改目前僅僅用于病原微生物基因檢測(cè)與部分遺傳性疾病診斷的局面,形成由腫瘤學(xué)、遺傳學(xué)、微生物學(xué)、藥物基因組學(xué)四足鼎立,快速發(fā)展的景象。