在肝臟芯片上進行肝細胞三維培養(yǎng)取得重大進展

肝臟芯片（liver-on-a-chip）細胞培養(yǎng)裝置是藥物發(fā)現(xiàn)、毒理研究和組織工程研究中的有吸引力的仿生模型。為了在實驗室芯片上維持特定的肝細胞功能，必須具備充足的細胞類型和培養(yǎng)條件，包括三維細胞定位和持續(xù)的營養(yǎng)物和氧氣供應(yīng)。與傳統(tǒng)的二維細胞培養(yǎng)技術(shù)相比，器官芯片（organ-on-a-chip）裝置提供了多功能性和有效的仿生技術(shù)，適用于藥物發(fā)現(xiàn)和醫(yī)學(xué)上的高級應(yīng)用。

在一項新的發(fā)表在Biofabrication期刊上的研究中，Jonas Christoffersson及其同事們證實了模仿胞外基質(zhì)的水凝膠如何支持灌注肝臟芯片裝置中的肝細胞功能和活力。這些研究人員設(shè)計了一種基于透明質(zhì)酸和聚（乙二醇）（HA-PEG）聚合物的水凝膠系統(tǒng)。他們利用點擊化學(xué)開發(fā)出這種水凝膠。為了做到這一點，他們讓環(huán)辛炔部分和炔烴疊氮化物標記的反應(yīng)物之間發(fā)生雙正交反應(yīng)（在生命系統(tǒng)內(nèi)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)，沒有天然生物化學(xué)反應(yīng)的干擾），即應(yīng)變促進的炔烴疊氮化物環(huán)加成（strain-promoted alkyne azide cycloaddition, SPAAC）。

圖片來自Biofabrication, doi:10.1088/1758-5090/aaf657

通過與現(xiàn)有的瓊脂糖和藻酸鹽水凝膠相比較，這些研究人員在細胞相容性（cytocompatibility）方面設(shè)計并表征了這種新型凝膠材料。對于生物功能化研究，他們使用了源自人誘導(dǎo)性多能干細胞的肝細胞（hiPSC-HEP）。為了改善這種生物材料的表面細胞相容性，利用疊氮化物修飾的細胞粘附基序改變HA-PEG水凝膠，從而促進有效的細胞-材料附著。在這種表面功能化的生物材料中，這些產(chǎn)生肝細胞的人誘導(dǎo)性多能干細胞（hiPSC）在三維空間中遷移和生長，并且具有增加的活力。與在其他水凝膠上培養(yǎng)的細胞相比，他們觀察到在這種新材料上的白蛋白（一種特征性的肝臟蛋白）產(chǎn)量更高。這種靈活的對hipsC-HEP進行灌注三維細胞培養(yǎng)的SPAAC交聯(lián)水凝膠系統(tǒng)是優(yōu)化肝臟芯片裝置的有前途的材料。

稱為“器官芯片”的小型化生物反應(yīng)器最近已成為一種替代性的細胞培養(yǎng)模型，可更好地模擬實驗室中的體內(nèi)生物微環(huán)境。鑒于在臨床藥物開發(fā)的所有階段觀察到藥物肝毒性，肝臟是醫(yī)學(xué)研究中的一種特別令人感興趣的模型。之前的研究已詳細介紹了使用器官芯片來預(yù)測藥物在臨床試驗中的影響，并評估實驗室中藥物與肝細胞之間的相互作用。

鑒于生物反應(yīng)器在學(xué)術(shù)和工業(yè)環(huán)境中的廣泛應(yīng)用，它們需要優(yōu)化的材料和條件以便實現(xiàn)高通量制造。這些條件包括替換常見的原型材料聚二甲基硅氧烷（PDMS），將源自hipsC的細胞整合到柔軟的生物材料上來促進它們的生長，并最大限度地減少由器官芯片裝置中的微流體容器和管道系統(tǒng)引起的較大死區(qū)體積。

這項研究中制備的新型生物材料含有兩種通過SPAAC交聯(lián)在一起的主要成分：cycloocytne修飾的透明質(zhì)酸（cycloocytne-modified hyaluronan, HA-BCN）和多臂疊氮化物修飾的PEG [p(N3)8]。HA-BCN中的BCN與末端為疊氮化物（N3）部分的8臂PEG聚合物上的N3發(fā)生反應(yīng)，從而形成穩(wěn)定的1,2,3-三唑類化合物。Christoffersson等人在生理條件下完成化學(xué)反應(yīng)，這就形成粘彈性可調(diào)整的水凝膠。這種交聯(lián)策略是制備用于三維細胞培養(yǎng)的水凝膠的理想選擇，這是因為細胞能夠被包埋在這種生物材料中而不會破壞它們的活力并且適合用于微流體裝置中。他們在這種新型生物材料上使用了過量的SPAAC部分來連接不同的配體，包括促進在細胞-材料界面相互作用的RGD肽。

在此之后，這些研究人員通過振蕩流變學(xué)技術(shù)（oscillatory rheology, 測量軟材料的粘彈性行為的技術(shù)）來改變這兩種主要成分的組成，以便了解所產(chǎn)生的粘彈性，比如這種水凝膠的儲能模量（storage modulus, G'）和損耗模量（loss modulus, G"）。他們在升高的溫度下控制了這種新型水凝膠的凝膠化動力學(xué)。這種新型生物材料的凝膠化動力學(xué)對細胞均勻分布來說足夠慢，但對防止細胞沉降來說足夠快?？刂颇z化動力學(xué)的能力讓他們能夠考慮微流體系統(tǒng)中用于器官芯片上的多種生物制造策略（比如生物打印）和水凝膠組裝。

Christoffersson等人接下來將HA-PEG水凝膠與成熟的三維細胞培養(yǎng)支架---瓊脂糖和藻酸鹽水凝膠---進行比較。為了確定適合于三維細胞培養(yǎng)實驗的最終粘彈性，他們使用振蕩流變學(xué)技術(shù)來研究不同的聚合物濃度。他們通過使用掃描電子顯微鏡（SEM）圖像分析了最終材料的組成。

肝臟芯片設(shè)計和設(shè)置必須滿足這項研究中的兩個關(guān)鍵標準：（1）允許灌注的細胞培養(yǎng)基通過這種水凝膠的表面，以便與包封的肝細胞進行穩(wěn)定的營養(yǎng)培養(yǎng)基交換；（2）在正在進行的細胞培養(yǎng)期間，允許對灌注的細胞培養(yǎng)基進行取樣用于實驗分析，同時又不影響肝細胞和這種水凝膠。

為了滿足這些標準，這些研究人員使用了一種商業(yè)化的三維細胞培養(yǎng)裝置（μ-Slide III 3D Perfusion IbiTreat），它包含兩個連續(xù)的腔室（2 x 30 μL）---每個腔室連接到培養(yǎng)基容器以便灌注液體。為了有效灌注，他們通過在含有這種水凝膠的腔室內(nèi)反轉(zhuǎn)灌注液流動方向?qū)⑦@種三維細胞培養(yǎng)裝置安裝在自動搖床上。這種實驗設(shè)置允許灌注的培養(yǎng)基通過這種三維細胞培養(yǎng)裝置，這就滿足了第一個標準。為了滿足第二個標準，與這些水凝膠腔室相鄰的局部壁允許他們在不干擾水凝膠或細胞成分的情況下對灌注液進行取樣。

在細胞培養(yǎng)3天、7天和9天后，這些研究人員首先用這種水凝膠包埋的HEPG2細胞（一種肝癌細胞系）來研究肝臟芯片裝置的生物功能化。他們將這種水凝膠包埋的HEPG2細胞形態(tài)、活力和功能與瓊脂糖和藻酸鹽水凝膠進行了比較。這項研究包括活/死細胞測定以確認細胞活力，并通過檢測細胞培養(yǎng)物上清液中的白蛋白和尿素分泌來進一步證實HepG2功能。

為了改善細胞的功能性（在材料表面上的附著力和遷移性），這些研究人員將細胞粘附基序---比如線性或環(huán)狀RGD肽（線性linRGD或環(huán)狀cRGD）---移植到這種水凝膠上。在這種情況下，將hipsC-HEP細胞（肝細胞干細胞）在不同的水凝膠組合物中培養(yǎng)13天，以研究細胞-材料相互作用后的形態(tài)和活力（活/死細胞染色）。他們在實驗中使用了六種不同的基于水凝膠的生物材料表面，包括：二維生物材料表面（HEP涂層），瓊脂糖，藻酸鹽，HA-PEG，HA-PEG（linRGD）和HA-PEG（cRGD）。

在這種修飾的水凝膠中包埋和培養(yǎng)的hiPS-HEP細胞在二維構(gòu)建體和真正的三維構(gòu)建體內(nèi)生長。為了測試這些體外培養(yǎng)的hiPS-HEP細胞的功能，這些研究人員定量確定了它們的白蛋白和尿素分泌。結(jié)果顯示僅在二維HEP涂層上和在cRGD基序水凝膠存在下培養(yǎng)的hips-HEP上清液分泌白蛋白。

基于這些研究結(jié)果，這些研究人員將二維HEP涂層上較高的白蛋白數(shù)量歸因于這種水凝膠中的白蛋白擴散速率；在二維HEP涂層上的擴散速度比三維構(gòu)建體中的快。在結(jié)合著cRGD基序的水凝膠中較高濃度的白蛋白與這種在結(jié)合著cRGD的生物材料表面上觀察到的細胞生長和活力增加相關(guān)聯(lián)。因此，他們打算使用cRGD肽來協(xié)助hips-HEP在未來用于肝臟芯片裝置的水凝膠上的培養(yǎng)。

通過這種方式，這項研究詳細說明了在肝臟芯片裝置中使用基于透明質(zhì)酸-PEG的經(jīng)過RGD肽修飾的水凝膠進行肝細胞三維培養(yǎng)（將近13天）的優(yōu)點。作為這項研究的基準，Christofferfsson及其同事們使用了常用的藻酸鹽和瓊脂糖水凝膠。在未來，他們將優(yōu)化這種HA-PEG水凝膠系統(tǒng)的粘彈性和細胞粘附基序的濃度，以便實現(xiàn)仿生細胞相容性。這種優(yōu)化的水凝膠系統(tǒng)可與這種肝臟芯片裝置相結(jié)合，從而有助于開發(fā)出生理上重要的肝臟芯片平臺，用于藥物毒理學(xué)、藥物發(fā)現(xiàn)和再生醫(yī)學(xué)方面的臨床研究。