基于微流控紙芯片的病原體檢測方法研究進展

大連大學醫(yī)學院 大連大學環(huán)境與化學工程學院

病原體的快速檢測和準確鑒定在臨床實驗室檢測、食品工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測方面至關(guān)重要，現(xiàn)有的細菌培養(yǎng)、核酸擴增和酶聯(lián)免疫等病原體診斷方法或耗時費力，或需要復雜的儀器設(shè)備，不適合現(xiàn)場即時檢測，因此，目前亟需一種快速有效檢測病原體的新方法。

微流控紙芯片逐漸成為檢測病原體感染的新工具，紙基微流控芯片(paper-based microfluidics)或微流控紙基分析設(shè)備(microfluidic paper-based analytical device, μPADs)簡稱紙芯片，是由 Martinez等在2007年首次提出，其用紙張作為基底代替硅、玻璃、高聚物等材料，在紙上加工出具有一定結(jié)構(gòu)的親疏水微細通道網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)分析器件，構(gòu)建“紙上微型實驗室”，可用于尿、唾液、血等多種物質(zhì)的分析與檢測，為早期診斷和早期治療提供了平臺。紙芯片成本低，制作簡單，攜帶方便，可在現(xiàn)場采樣并迅速檢測分析，實現(xiàn)真正意義上的即時檢測(point-of-care testing, POCT)。本文旨在介紹微流控紙芯片的病原體檢測方法和紙芯片微流控技術(shù)的發(fā)展前景。

目前，紙芯片應(yīng)用研究主要集中于醫(yī)學、生物學和環(huán)境監(jiān)測，根據(jù)檢測原理可以把紙芯片病原體檢測分為四類：比色檢測、熒光檢測、化學發(fā)光檢測和電化學發(fā)光檢測。

基于比色檢測法的微流控紙芯片

比色檢測法是目前紙芯片分析研究中最常見的檢測方法，通過顯色反應(yīng)使待檢測組分轉(zhuǎn)化為有顏色的物質(zhì)，這種檢測既可直接通過肉眼辨別實現(xiàn)定性檢測，也可采用數(shù)碼相機或智能手機拍照、掃描儀掃描成圖像，利用顏色深度與待測組分濃度的相關(guān)性來實現(xiàn)半定量或定量檢測。比色檢測根據(jù)標記物的不同可分為紙基-酶聯(lián)免疫吸附實驗(P-ELISA)、膠體金相關(guān)紙芯片、其他比色法紙芯片。

P-ELISA

P-ELISA將ELISA的靈敏性和特異性與低成本、易使用的紙張平臺相結(jié)合，在紙上制作96微孔板進行檢測。早在2010年，Cheng等首次用P-ELISA方法檢測血清樣品中的人類免疫缺陷病毒，研究表明P-ELISA比傳統(tǒng)ELISA法更快更便宜，但靈敏度稍差。隨著檢驗技術(shù)的進步，目前P-ELISA不僅縮短了時間，而且提高了靈敏度。Khan等利用P-ELISA檢測T7噬菌體，可在30min內(nèi)得出檢測結(jié)果，檢測范圍為100~109 PFU/mL，而傳統(tǒng)ELISA法檢測時間多達幾小時，檢測范圍為2×105~2×107 PFU/mL。Larsson等在改進的濾紙上檢測M13噬菌體，其中聚電解質(zhì)多層(PEM)由丙烯酸(PAA)和烯丙胺鹽酸鹽(PAH)組成，有利于病毒的靜電吸附，該方法的檢測時間<2 h，檢測限可達到5×104 PFU/mL，而傳統(tǒng)夾心ELISA法檢測時間至少3~4 h，檢測限為107 PFU/mL。

紙芯片在酶聯(lián)免疫方面的改進不僅體現(xiàn)在縮短檢測時間和提高檢測靈敏度，還體現(xiàn)在簡化操作步驟并實現(xiàn)了自動化控制。Sanja等開發(fā)了一種簡單的小型化紙/PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)混合微流控微孔板，用于在不發(fā)達地區(qū)定量檢測免疫球蛋白G(IgG)和乙肝表面抗原(HBsAg)，該方法使用流通微孔中的多孔紙，有助于抗體/抗原固定化和有效洗滌，紙張表面不需其他化學修飾，此外，頂端試劑輸送通道可以簡單地將試劑轉(zhuǎn)移至多個微孔中，避免重復的手動移液或使用昂貴的機器人，實現(xiàn)自動化控制。

膠體金相關(guān)紙芯片

膠體金是金鹽被還原成金原子后形成的金顆粒懸液，在病原體檢測中常作為示蹤標記物或顯色劑。Lei等在紙芯片上通過膠體金標記抗體實現(xiàn)對甲型H1N1和H3N2流感病毒的檢測和亞型分析，紙張經(jīng)殼聚糖修飾，在反應(yīng)中加入金增強(GE)試劑，使得每個檢測區(qū)域只需加入5 μL樣品即可在1 h內(nèi)完成流感病毒檢測，檢測限H1N1為2.7×103 PFU/mL，H3N2為2.7×104 PFU/mL，在臨床檢測中要達到相同檢測限的RT-PCR法耗時6 h。另外，該方法可從感染細胞的裂解物和臨床樣品中檢測流感病毒，進一步證實了基于紙張的免疫測定的可靠性。

膠體金免疫層析法在紙芯片病原體檢測中有很多研究。Fu等介紹了一種全自動擴增的二維紙網(wǎng)絡(luò)測定法，該方法用來檢測瘧疾蛋白PfHRP2，其紙芯片能夠?qū)崿F(xiàn)膠體金信號放大，試劑與樣品同步輸送，檢測限為(2.9±1.2)ng/mL，是未用信號放大試劑(10.4±4.4)ng/mL的1/4，與傳統(tǒng)ELISA法的檢測限相當。Khan等利用抗體偶聯(lián)金納米顆粒檢測霍亂毒素，根據(jù)吸光度比(A605/A523)的變化對霍亂毒素濃度進行定量分析，利用動態(tài)光散射(DLS)測量金納米顆粒的大小，確認比色法的結(jié)果。另外，金顆粒的聚集導致可見的顏色變化，實現(xiàn)目測霍亂毒素濃度低至10 nmol/L，低于先前報道的比色法的目測濃度(54 nmol/L)。

膠體金標記的核酸雜交技術(shù)與紙芯片結(jié)合提供了新的病原體檢測平臺。以結(jié)核分枝桿菌檢測為例，Veigas等將膠體金探針與特定DNA靶序列雜交，通過減少膠體金顆粒的偶聯(lián)使顏色保持紅色，從而區(qū)分靶序列與非互補序列。該芯片將這種比色測定法整合到384微孔板上，用智能手機量化紙的顏色變化，將數(shù)據(jù)傳輸至異地進行處理，可在2 h內(nèi)篩選結(jié)核分枝桿菌的核酸分子，每個檢測加樣量為5 μL，少于在塑料材質(zhì)上15 μL的加樣量，但經(jīng)巰基修飾的ssDNA序列通過Au-S鍵形成的膠體金探針制備過程需專業(yè)人員操作且耗時長。因此，Tsai等通過未修飾的金納米顆粒和單鏈寡核苷酸雜交實現(xiàn)快速診斷，利用鹽誘導的膠體金溶液檢測結(jié)核分枝桿菌的DNA序列，不需要多個PCR循環(huán)擴增特異性DNA靶序列，無需復雜且耗時的硫醇化或其他表面修飾的制備探針的過程，制作方法簡單快捷，該設(shè)計可以檢測到濃度為 2.6 nmol/L的結(jié)核分枝桿菌靶序列，檢測時間約為1 h，低于傳統(tǒng)檢測方法(痰涂片鏡檢、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和分子種類診斷)的檢測時間。

其他比色法紙芯片

除了P-ELISA、膠體金相關(guān)紙芯片之外，還有用其他比色法檢測病原體的紙芯片。Murdock等在不同的緩沖液條件下，基于紙張平臺進行酶底物反應(yīng)，通過顏色變化定性檢測甲型和乙型流感病毒，通過觀察樣品是否受抗病毒藥物(如達菲)的影響，實現(xiàn)了同步檢測流感病毒的耐藥性。Jokerst等在濾紙上檢測食品樣品中的大腸埃希菌O157∶H7、單核細胞增多性李斯特菌和鼠傷寒沙門菌，利用物種特異性酶與底物的相互作用，由不同顏色變化確定三種病原菌的存在，8~12 h內(nèi)可檢測濃度為10 CFU/cm2的致病菌，低于文獻報道的最低限值(100 CFU/cm2)，而檢測食源性細菌的金標準細菌培養(yǎng)法需要耗時5~7 d，因此該設(shè)計為準確簡便地檢測多種病原菌提供了可能。

基于熒光檢測法的微流控紙芯片

熒光檢測法的原理是基于蛋白質(zhì)、DNA以及氨基酸等生化樣品本身有熒光，或者可以用熒光試劑標記，激光誘導熒光進行測定，熒光強度與入射光強度、量子效率、樣品濃度成正比。在微流控紙芯片檢測中，熒光檢測法的靈敏度高于比色檢測法。Cho等通過角度特異性米氏散射量化免疫凝集的程度，用智能手機檢測綠色熒光信號，在紙芯片上實現(xiàn)病原菌的免疫凝集檢測，總測定時間<30 s，該研究中大腸埃希菌 K12和淋病奈瑟球菌的檢出限均為10 CFU/mL，低于市售的淋病快速試劑盒檢出限(106 CFU/mL)和大腸埃希菌檢測條(亞硝酸鹽檢測條)的檢出限(106 CFU/mL)。Miranda等用熒光標記的多克隆抗體作為識別器早期診斷大豆銹病，該免疫傳感器具有高度特異性和敏感性，檢測時間明顯少于ELISA和PCR法，檢測限低至2.2 ng/mL，與ELISA和PCR檢測方法的檢測限相當，是免疫層析法的1/100。

將紙(或膜)提前用融合蛋白處理比將抗體直接包被在紙(或膜)上的靈敏度高。Rosa等介紹了將具有融合蛋白的抗體錨定在紙上捕獲熒光素標記的DNA鏈和雜交體的方法，其中碳水化合物結(jié)合模塊(CMB)與葡萄球菌蛋白A的ZZ片段形成CBM-ZZ構(gòu)建體，通過識別IgG抗體的Fc段，促進纖維素紙固定蛋白，該芯片可以檢測ESAT-6(一種編碼來自結(jié)核分枝桿菌分泌蛋白的基因)的寡核苷酸序列。

Funes-Huacca等將紙張、膠帶與透氧不透水的聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜相結(jié)合制出一款紙芯片，該芯片模擬細菌的生長環(huán)境，使用平板掃描儀或手機相機量化具有熒光標記的細菌增殖，該方法大腸埃希菌的檢測限低至1~10 CFU/100μL，可用于不發(fā)達地區(qū)的現(xiàn)場測試和農(nóng)場中動物健康測試等。Lo等通過使用商業(yè)化的熒光探針(標記雙鏈DNA)與DNA相結(jié)合，在紙張上檢測登革熱，對紙芯片上的熒光環(huán)介導逆轉(zhuǎn)錄等溫擴增(RT-LAMP)產(chǎn)物進行量化分析，為開發(fā)基于紙芯片的體外早期登革熱診斷裝置提供了依據(jù)。

Kurdekar等開發(fā)基于碳量子點的免疫紙芯片用于快速檢測HIV-1 p24抗原，碳量子點在光激發(fā)下自發(fā)熒光，光學穩(wěn)定性強，與有機熒光體相比，量子點具有簡單、便宜、漂白及低毒等特點，將制作簡單的紙芯片與高度特異的碳量子點相結(jié)合，用于早期HIV感染的快速篩查。

基于化學發(fā)光檢測法的微流控紙芯片

化學發(fā)光是根據(jù)化學反應(yīng)在某個時刻發(fā)射的光強度來確定反應(yīng)中某一組分濃度的方法，不需任何外加光源?；瘜W發(fā)光檢測法可以與紙芯片相組合，建立廉價和高敏感的新型化學發(fā)光生物傳感器。Wang用N，N-二琥珀酰亞胺基碳酸酯(DSC)制備DNA傳感器，將傳感器共價固定在紙芯片上捕獲DNA，核酸雜交反應(yīng)后，在DNA生物傳感器上捕獲碳量子點標記的DNA信 號，高錳酸鉀將空穴注入到碳點中，高能帶中的電子與氧化劑注入空穴湮滅產(chǎn)生化學發(fā)光信號，最終通過分析化學發(fā)光信號的強度定量檢測目標DNA，該方法靈敏度可達到8.56×10-19 mol/L，但超弱發(fā)光分析儀檢測器價格昂貴，不適合現(xiàn)場即時檢測。Liu等首先提出了電荷藕合器件(CCD)傳感器與紙芯片化學發(fā)光檢測的綜合應(yīng)用，開發(fā)了一種新型的紙基微流體化學發(fā)光DNA生物傳感器，通過DNA探針和生物素標記的DNA鏈的雜交反應(yīng)檢測李斯特菌的DNA片段，使用低成本的CCD成像裝置作為檢測器檢測發(fā)光信號，該方法所提供的DNA生物傳感器分析性能好，且有助于在紙芯片上實現(xiàn)簡單、低成本和便攜式的化學發(fā)光檢測，其檢測范圍為1.94×10-1~1.94×104 pmol/L，檢測限為6.3×10-2pmol/L，檢測限比具有CCD 檢測器的其他微流控電化學DNA測定的檢測限低3~5個數(shù)量級。

基于電化學發(fā)光檢測法的微流控紙芯片

電化學發(fā)光法是在化學發(fā)光和電化學基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的分析方法，是通過電驅(qū)動促使某些物質(zhì)發(fā)生電化學反應(yīng)形成激發(fā)態(tài)，并通過輻射光子返回基態(tài)，并對發(fā)光強度進行測量的一種分析方法，與化學發(fā)光傳感器相比，電化學發(fā)光生物傳感器背景信號低、分析物范圍廣、靈敏度高、利于實現(xiàn)多重檢測，減少樣品消耗，提高空間分辨率，降低操作復雜度，縮短測定時間，提高樣品通量。Feng等制造了IA型一次性紙基還原雙極電極(BPE)陣列檢測多種病原體DNA，組裝在BPE陰極上的發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA與互補靶DNA結(jié)合，與鉑納米顆粒 (PtNPs)標記的探針DNA雜交，經(jīng)PtNPs催化的氧氣被還原產(chǎn)生電化學發(fā)光信號，這種基于紙張的BPE陣列傳感器實現(xiàn)了對梅毒螺旋體基因、免疫缺陷病毒基因和乙型肝炎病毒基因的多重分析。

結(jié)語

紙芯片制作簡單，便攜性好，樣品用量少，成本低及易集成化等，其研究及應(yīng)用日益受到關(guān)注?；诒壬z測的紙芯片易于操作并可直接讀出信號，是最常見的檢測手段，但其應(yīng)用常受到低靈敏度的限制；熒光檢測較比色法具有更高的靈敏度，但存在嚴重背景熒光和紙的光散射問題，使測定很難直接在紙芯片上進行。化學發(fā)光法不需外加光源，靈敏度較高，儀器設(shè)備簡單，易于實現(xiàn)微型化和集成化，但需黑暗的檢測環(huán)境，且大多數(shù)檢測器價格昂貴，尋求低成本的檢測器依舊是研究的關(guān)鍵。電化學發(fā)光方法簡單，靈敏度高，易于定量，環(huán)境光獨立以及紙張干擾低等，逐步被應(yīng)用于紙芯片，但電化學發(fā)光紙芯片幾乎所有現(xiàn)有器件都需要昂貴的恒電位儀，將電極添加到檢測區(qū)域會增加復雜性和每次測試的成本，發(fā)展基于紙芯片平臺的低成本的檢測設(shè)備和紙芯片制備方法是該領(lǐng)域的重要研究方向。見表1。

表1 四種微流控紙芯片檢測方法的特點

近幾年紙芯片的研究逐年增加，但其商業(yè)化過程依然存在較多問題。現(xiàn)有研究中經(jīng)常忽視不同測試條件(如溫度、濕度、環(huán)境光、樣品基質(zhì)的復雜度)下的性能分析，而這些對紙芯片的現(xiàn)場即時檢測非常重要，該方法的穩(wěn)定性和干擾因素研究是推動病原體檢測紙芯片發(fā)展的關(guān)鍵問題之一。紙芯片作為一種微全分析系統(tǒng)，其在樣品的分離、富集、反應(yīng)、檢測方面的功能并不是很完備，尤其對于復雜多體系的組分很難實現(xiàn)同步檢測，研發(fā)紙芯片同步相應(yīng)檢測方法，實現(xiàn)對復雜多體系組分的檢測也是日后的研究方向。為了改善紙芯片的分析性能，往往涉及到多種化學試劑的使用和多步預處理操作，這增加了檢測流程的復雜性，實現(xiàn)檢測流程標準化也是研究的一個方向。

Kumar等的報告闡述了目前紙芯片發(fā)展大多停留在實驗室研究階段，少有紙芯片真正應(yīng)用于現(xiàn)場即時檢測。因此，隨著該領(lǐng)域的快速發(fā)展，我們通過運用各種技術(shù)手段，著力于紙芯片的實際應(yīng)用，使得未來紙芯片的發(fā)展擁有更大的影響力。