多通道抗凝血藥物篩選檢測儀的研制

 摘要：介紹一種以透射比濁法為設(shè)計(jì)原理，單片機(jī)89C52為核心的96通道高速抗凝血藥物篩選平臺(tái)。該儀器自動(dòng)完成血液（血漿）凝血時(shí)間的實(shí)時(shí)檢測及數(shù)據(jù)采集，數(shù)據(jù)采集的精度、速度及靈敏度較傳統(tǒng)的凝血時(shí)間測量儀器有較大的提高。提出了將凝血時(shí)間測量用于相關(guān)藥物篩選的新途徑。

血液凝固的過程非常復(fù)雜的。生物體在正常生理狀態(tài)下，血液中的凝血系統(tǒng)與抗凝血系統(tǒng)處于自我調(diào)節(jié)的一種平衡狀態(tài)，如果這種平衡被破壞，就會(huì)形成凝血系統(tǒng)疾病?，F(xiàn)在臨床上最常用的抗凝血類藥物是肝素，這種藥物雖然有很好的抗凝血效果，卻伴隨著血和血小板減少等副作用，而且當(dāng)患者本身患有彌散性血管內(nèi)凝血等疾病時(shí)便無法采用。現(xiàn)有的口服類抗凝血藥物（如節(jié)丙酮香豆素[1]）的使用效果又不甚理想。因此，新型抗凝血藥物的研制工作是非常必要的。

進(jìn)行抗凝血藥物開發(fā)的第一步就是要檢驗(yàn)藥物的抗凝效果，也就是凝血時(shí)間的檢測?，F(xiàn)在際上普通認(rèn)可的測量凝血時(shí)間的指標(biāo)主要有兩個(gè)：凝血酶原時(shí)間（Prothrombin Time,PT）和活化部分凝血活酶時(shí)間（Actived Partial Thromboplastin Time,APTT）。這兩個(gè)指標(biāo)是由國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（ICSH）、估計(jì)血檢與止血委員會(huì)（ICTH）和美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）聯(lián)合制定分布的[2]。PT和APTT不僅能取代傳統(tǒng)的Duke法出血時(shí)間和玻片法凝血時(shí)間而作為新的臨床止血功能指標(biāo)，并且能為抗凝血藥物開發(fā)過程提供更好的監(jiān)控指標(biāo)。

正常的凝血過程時(shí)間很短，即使加入抗凝劑，也不會(huì)超過1分鐘。正常情況下，PT不會(huì)超過20秒，這給手工測量帶來了很大的困難。為了尋求方便的檢測途徑，國內(nèi)外許多企業(yè)已經(jīng)開始研制相關(guān)的自動(dòng)化凝血時(shí)間測量儀，并且已經(jīng)投放市場如德國TECO公司的TEChrom IV plus 4通道半自動(dòng)血栓/止血測定儀；法國BIOCHEM公司STAGO全自動(dòng)血栓/止血分析儀等。這些凝血測量儀雖然可以完成一個(gè)或幾個(gè)樣品的同時(shí)檢測，但是仍然沿用臨床檢測的套路，檢測速度有限，樣品用量比較大，樣品波大都固定于儀器上，清洗不方便，同時(shí)價(jià)格也相當(dāng)昂貴，不適用于藥物開發(fā)。

為了提高凝血測量儀的性能，同時(shí)滿足高通量的藥物篩選的需求，我們利用單片機(jī)設(shè)計(jì)了一套新型的凝血時(shí)間自動(dòng)檢測儀，目的在于為新藥開發(fā)質(zhì)量控制提供便利。這臺(tái)小型的凝血時(shí)間測量裝置（體積僅30cm×20cm×12cm）不僅能夠進(jìn)行96路并行實(shí)時(shí)檢測，而且樣品用量少（20μl），靈敏度高（0.1秒），具有很好的應(yīng)用前景。

1 測量原理

血液的凝固從物理上來講就是非溶性纖維蛋白形成的過程，而且在很短的時(shí)間內(nèi)非溶性纖維蛋白的數(shù)量會(huì)陡然增加。這樣，整個(gè)血液的透光率就會(huì)迅速降低（濁度升高），一段時(shí)間后就會(huì)漸漸變緩。通常我們所測量的凝血時(shí)間也就是指非溶性纖維蛋白形成的起始階段，即濁度變化達(dá)到三倍信澡比的時(shí)間。

透射比濁法正是利用了血液在凝血過程中濁度突然升高的原理來設(shè)計(jì)的。只要檢測器件具有足夠的靈敏度，就可以檢測出血液凝固的時(shí)間。

2 檢測儀設(shè)計(jì)

2.1 樣品池設(shè)計(jì)

檢測儀采用標(biāo)準(zhǔn)平底透明96孔板作為樣品池，其上、下方分別為一一對(duì)應(yīng)光敏二極管和發(fā)光二極管，樣品池采用抽屜式結(jié)構(gòu)。每次使用可以將抽屜拉出，放上96孔板，再加入凝血試劑和血液（血漿），然后啟動(dòng)檢測開關(guān)，開始數(shù)據(jù)采集。

2.2 電路設(shè)計(jì)

由于通過光敏二極管接收到的電壓信號(hào)變化量往往比較低（幾個(gè)mV），對(duì)于光源手檢測器件的選擇至關(guān)重要的。因此，在儀器設(shè)計(jì)以前，首先選用了幾個(gè)不同的發(fā)光二極管（以下簡稱LED）和與其對(duì)應(yīng)的光敏二極管對(duì)凝血過程透光率進(jìn)行了實(shí)測相應(yīng)的理論計(jì)算。

圖1所示為光敏二極管的基本電路。二極管兩端的電流為：

式中，I為通過不敏二極管的電流，Is為反向飽和電流，VD為二極管兩端電壓，VT=kT/q稱為混度進(jìn)行當(dāng)量，其中k為玻爾茲曼常數(shù)，T為熱力學(xué)溫度，q為電子的電量。在300K時(shí)，VT≈26mV。反向偏置時(shí)，只要|VD|大于VT幾倍以上，I=-Is，其中負(fù)號(hào)表示反向電流。

實(shí)驗(yàn)證明，光敏二極管的反向電流在一定范圍內(nèi)與LED上的加載電壓存在正比的函數(shù)關(guān)系，如圖2所示。這是因?yàn)長ED正常發(fā)光過程中，LED加載電壓與輸出光強(qiáng)存在正比關(guān)系；光敏二極管的反向電流與其吸收光強(qiáng)也存在正比的函數(shù)關(guān)系。根據(jù)這一點(diǎn)我們可以做如下推斷：

假設(shè)通過光敏二極管的吸收光強(qiáng)為φ，則

I=-Is=Cφ+m≈Cφ

其中，C與m為僅隨溫度而變化的因子，m≈0。

與光敏二極管串聯(lián)的電阻R兩端電壓V=IR=CφR，并有：φ=φ0+Δφ，V=V0+ΔV,V0=CRφ0, ΔV=CRΔφ。其中，V0和φ0為凝血反應(yīng)開始之前R電阻兩端的電壓與光敏二極管的吸收光強(qiáng)。

在凝血反應(yīng)開始之后的某一時(shí)刻，吸收光強(qiáng)為φ=φ0(1-ε)，ε為某一時(shí)刻光強(qiáng)變化的百分比，則Δφ=φ-φΔ0=-εφ0,所以

ΔV=-εCφ0R=-εV0 ΔV/V0=-ε

可以看到，電阻R兩端的電壓變化僅與ε和V0有關(guān)。ε對(duì)于固定時(shí)刻和固定的反應(yīng)體系來說是不變的，因此，ΔV僅與V0有關(guān)。也就是說，在某一確定的時(shí)刻，信號(hào)電壓變化的百分比只與反應(yīng)體系有關(guān)。根據(jù)這個(gè)結(jié)論，我們只要通過選擇合適的元器件并加以調(diào)節(jié)，提高初始輸入電壓V0，就可保證ΔV足夠大。

    在設(shè)計(jì)過程中，我們選擇光強(qiáng)高、波長適宜、直徑為5mm的藍(lán)色高亮發(fā)光二極管陣列作為光源，并連接可調(diào)節(jié)電源來同時(shí)控制所有發(fā)光二極管的亮度；選擇相應(yīng)的直徑為5mm的光敏二極管陣列作為檢測元件，串連50k電位器用于逐個(gè)調(diào)節(jié)每個(gè)二極管的初始輸出電壓，消除每對(duì)發(fā)光二極管和光敏二極管之間存在的個(gè)體差異；最后選擇高精度A/D轉(zhuǎn)換器來采集數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)測量顯示，當(dāng)溶液總體積不低于60μl時(shí)，采用16位的A/D轉(zhuǎn)換器便可滿足測量精度的要求。

圖3與基本結(jié)構(gòu)的原理圖。整個(gè)儀器以Atmel公司的AT89C52（以下稱間C52）單片機(jī)為核心實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)采集和控制，配合電-光-電轉(zhuǎn)換電路的A/D轉(zhuǎn)換器（ADC）等來檢測樣品的透光率及其變化。A/D轉(zhuǎn)換器采用Analog Devices公司的16位ADC——AD7660，儀器分辨率達(dá)到2 16，大致相當(dāng)于一個(gè)4位半萬用表的精度；ADC的量程是0～2.5V。

單片機(jī)設(shè)置完成D/A轉(zhuǎn)換器（MAX7224KCWN，8-bitDAC，Maxim Integrated Products）后，光敏二極管串聯(lián)電位器上的電壓數(shù)據(jù)通過多路模擬開關(guān)（MAX306CWI，16-Channel,Maxim Integrated Products）選擇后送到ADC進(jìn)行模數(shù)轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)被C52讀取。C52發(fā)出的數(shù)據(jù)再經(jīng)MAXRS232（MAXRS232CWE，Maxim Integrated Products）進(jìn)行電平轉(zhuǎn)換，通過串口傳入計(jì)算機(jī)。

2.4 軟件設(shè)計(jì)

編程采用微軟公司的Microsoft Visual Basic 6.0，功能實(shí)現(xiàn)包括以下四個(gè)主要部分：

（1）串口測試 使用前對(duì)連接串口進(jìn)行測試，工作正常則數(shù)據(jù)碼管顯示閃爍0。

（2）初始電壓檢查 檢查所有發(fā)光二極管和光敏二極管是否正常工作。為了讓所有并行孔的初始電壓盡可能接近，可以調(diào)節(jié)每個(gè)光敏二極管的對(duì)應(yīng)串聯(lián)電位器，這時(shí)數(shù)碼管顯示相應(yīng)電壓值（V）。

（3）設(shè)計(jì)檢測通道 可以任意選擇幾個(gè)通道進(jìn)行檢測，同時(shí)確定檢測時(shí)間。儀器還帶有檢測電源及外接通道的功能，正常運(yùn)轉(zhuǎn)情況下不用調(diào)節(jié)。

（4）實(shí)驗(yàn) 為了方便實(shí)驗(yàn)人員，實(shí)驗(yàn)的開始時(shí)間采用點(diǎn)動(dòng)開關(guān)控制。數(shù)碼管顯示時(shí)間。實(shí)驗(yàn)過程中可實(shí)時(shí)顯示任意四個(gè)通道的數(shù)據(jù)變化。實(shí)驗(yàn)正常完成，數(shù)碼管顯示0b。數(shù)據(jù)存在csv類型文件，該文件可以用excel打開。但由于excel最多只能顯示256列，因此最多只能顯示85個(gè)通道數(shù)據(jù)。這個(gè)問題可以通過excel導(dǎo)入csv文件數(shù)據(jù)解決，結(jié)果分成兩個(gè)文件顯示。

3 儀器參數(shù)及測量方法

開啟光源之后需要預(yù)熱20分種，待光源和溫度穩(wěn)定以后再開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的溫度控制由處于抽屜底部的熱敏傳感器來完成。由于整個(gè)檢測儀有較高的電流通過，在開啟預(yù)熱過程中溫度很容易超過37℃，因此我們沒有采用常用的加熱式和水浴式控溫電路，而是采用多個(gè)風(fēng)扇來控制較小空間內(nèi)的溫度升高。

抗凝血藥物篩選檢測儀的采集速率為1000個(gè)數(shù)據(jù)/秒，因此如果96路同時(shí)檢測，時(shí)間精度為0.1秒。因此當(dāng)測量通道少于96路，時(shí)間精度會(huì)進(jìn)一步提高。實(shí)驗(yàn)檢測樣本體積必須大于或等于20μl，總體積大于等于60μl。

在不加任何試劑的情況下開啟儀器采集數(shù)據(jù)，理論上每個(gè)通道采集到的電壓數(shù)據(jù)應(yīng)該保持不變，實(shí)際上可以得到由于各種干擾引起的系統(tǒng)誤差，多次重復(fù)得到系統(tǒng)誤差為2mV。根據(jù)臨床上的通常算法，以偏離基準(zhǔn)電壓三倍系統(tǒng)誤差的時(shí)間作為反應(yīng)起始時(shí)間，即凝血時(shí)間。溶液濁度增高，在光敏二極管上反映為電壓的下降。當(dāng)測量數(shù)據(jù)的電壓值低于基準(zhǔn)值6mV的時(shí)刻作為凝血時(shí)間，這種確定方法適用于PT和APTT。

以60μl凝血測量體系（20μl樣本+40μl凝血試劑）對(duì)儀器進(jìn)行檢測。隨機(jī)選擇六個(gè)通道進(jìn)行平行PT檢測，結(jié)果重復(fù)性良好，如表1所示。這里使用的PT試劑為Sigma公司的診斷試劑ThromboMAX with Calcium，其中1、2、3號(hào)樣本為正常新鮮血漿；4、5、6號(hào)為加入肝素作為抗凝劑的血漿。由于僅測量六路信號(hào)；PT檢測精確度提高至0.01秒。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)檢測，同一樣品在各個(gè)通道中檢測的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06，同一樣品在同一個(gè)孔中重復(fù)10位的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04。

表1 六路PT平行檢測結(jié)果

據(jù)報(bào)道，PT的正常測定值為12.4秒[2]，根據(jù)不同個(gè)體情況會(huì)有所偏差?？梢钥闯?，表1中的PT檢測結(jié)果是可靠的。通過PT時(shí)間還可算出PT比、PT活性百分比和國際標(biāo)準(zhǔn)化值INR（International Calibrated Ratio）。

設(shè)計(jì)的抗凝血藥物篩選檢測儀攜帶方便、成本較低、操作簡單、檢測速度及靈敏度高，不僅可以用于抗凝血藥物的大批量初篩，同時(shí)也可用于臨床大量血樣的凝血參數(shù)測定。這是我們所知到目前為止將凝血時(shí)間測量用于相關(guān)藥物篩選的首次報(bào)道。