集成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及增強機制的微流控生物傳感器用于檢測多種真菌毒素

真菌毒素被認為是食源性疾病的最重要原因之一，并受到全球范圍內(nèi)的長期關(guān)注。隨著公共衛(wèi)生意識的提高，一些組織已經(jīng)為食品中的真菌毒素設(shè)定了最大殘留限度（MRLS），以避免高風險行為。然而，大多數(shù)真菌毒素以微量的形式存在，對食品安全構(gòu)成了嚴重威脅。此外，存在于同一食品中的多種毒素的協(xié)同或拮抗作用增加了對人和動物的毒性。而面對物流全球化的發(fā)展趨勢，傳統(tǒng)的真菌毒素分析方法如高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）由于程序復(fù)雜、設(shè)備笨重、操作復(fù)雜，在一定程度上限制了其實際應(yīng)用。因此，建立和開發(fā)針對多種真菌毒素的靈敏、快速、準確的高通量檢測方法，以滿足食品質(zhì)量安全的要求已迫在眉睫。

為解決以上問題，淮陰師范學(xué)院、中國人民解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院和清華大學(xué)聯(lián)合研發(fā)了基于功能性DNA調(diào)節(jié)和過渡態(tài)CRISPR系統(tǒng)的超敏微流控生物傳感器（FTMB），實現(xiàn)了6種真菌毒素的同時定量檢測。在該系統(tǒng)中，觸發(fā)開關(guān)的高響應(yīng)性不受傳感界面的空間限制，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制使其能夠在復(fù)雜的生物背景下靈敏而特異地檢測小分子目標，能使真菌毒素和熒光信號之間建立直接的線性正相關(guān)。此外，該研究還進一步開發(fā)了具有高響應(yīng)特性的過渡態(tài)CRISPR系統(tǒng)并評價了微流控芯片中流道對流體的操縱以及PC基底對量子點探針熒光的增強作用。所構(gòu)建的FTMB系統(tǒng)具有小型化、批量生產(chǎn)和可調(diào)性等優(yōu)點，在實際樣品分析中表現(xiàn)良好，具有高通量、準確性和重現(xiàn)性，為多種真菌毒素的快速檢測提供了良好的平臺。相關(guān)工作以“Microfluidic Biosensor Integrated with Signal Transduction and EnhancementMechanism for Ultrasensitive Noncompetitive Assay of Multiple Mycotoxins”為題發(fā)表在Analytical chemistry期刊上。

圖1 FTMB系統(tǒng)的檢測原理圖 ?

CRISPR/Cas12a雙重轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的可行性

為了進一步確證功能DNA在真菌毒素檢測中的轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的實用性，研究人員將功能DNA調(diào)控的CRISPR系統(tǒng)激活機制分別采用單鏈DNA（ssDNA，19nt）和FAM標記的Cas12a通用型DNA探針（FAM-TTATT-BHQ1）。如圖2A所示，在沒有相應(yīng)激活子的反應(yīng)體系中，ssDNA保持完整（通道1-2）。在使用功能性DNA鎖定激活子（通道3-8）時，成功限制了CRISPR系統(tǒng)的裂解功能。在此基礎(chǔ)上，在相應(yīng)的真菌毒素（100 ng/mL）存在的情況下，6種真菌毒素的激活子可以觸發(fā)相應(yīng)的CRISPR系統(tǒng)的反式切割活性，使ssDNA被切割成隨機短片段（通道9-14）。這種降解現(xiàn)象表明，6種適配子-1/激活子/適配子-2作為觸發(fā)開關(guān)可以成功啟動后續(xù)的級聯(lián)反應(yīng)。

為了驗證聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，基于功能DNA的觸發(fā)開關(guān)在常規(guī)CRISPR/12a熒光檢測系統(tǒng)中被進一步測試。實時熒光曲線顯示，在激活子不存在或鎖定時，熒光信號幾乎不積累，而在激活子存在或解鎖時，熒光值迅速增加（圖2B）。根據(jù)熒光測試結(jié)果（圖2C），功能DNA與激活子的最佳配比均為2:1。聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光定量分析結(jié)果表明，功能DNA具有識別目標分子的能力，同時激活子被成功鎖定。

為了進一步提高傳感器的檢測靈敏度和抗干擾能力，選用QDs作為一種全新的CRISPR系統(tǒng)探針的供體材料。與常規(guī)CRISPR探針相比，QDs的窄帶發(fā)射光譜和高的量子產(chǎn)率有利于高度匹配光子晶體的光子帶隙。此外，得益于QDs的寬吸收光譜，信號輸出可以在簡單的紫外燈照射下實現(xiàn)?？紤]到綠色熒光波段是最常見的檢測輸出信號，因此選擇發(fā)射波長為520 nm的QDs。為了構(gòu)建適合CRISPR系統(tǒng)的FRET模型，將含有淬滅基團BHQ1的DNA報告子修飾在量子點的表面，實現(xiàn)熒光猝滅。DNA報告子的濃度被進一步優(yōu)化以達到最佳的猝滅效率。如圖2D，猝滅效率隨報告子濃度的增加而增加，直至在6 nmol（~100%）時達到完全猝滅。

圖2 CRISPR/Cas12a雙重轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的可行性 ?

用于真菌毒素檢測的過渡態(tài)CRISPR系統(tǒng)的建立

同時具有不同形式Cas12a酶（封閉、中間和開啟）處于動態(tài)平衡狀態(tài)的CRISPR系統(tǒng)很容易用少量的激活子改變這種平衡，這有利于激活更多的Cas12a酶，從而使整體反式裂解活性大幅度提高。因此，推測CRISPR系統(tǒng)最敏感的狀態(tài)是亞穩(wěn)態(tài)，即使是少量的激活子也可以很容易地激活Cas12a酶，誘導(dǎo)較強的裂解活性。由圖3A（2）可以看出，在激活子濃度相同的情況下，不同crRNA對應(yīng)的CRISPR體系的反式切割活性不同。這是因為單個CRISPR系統(tǒng)的裂解活性是由多組分的性質(zhì)共同驅(qū)動的，組分的結(jié)構(gòu)和比例會對整個CRISPR系統(tǒng)的特性產(chǎn)生不同的影響。根據(jù)所選擇的能夠刺激Cas12a酶高活性的crRNA和激活子序列，調(diào)整組成比例有助于實現(xiàn)對低濃度目標真菌毒素的高響應(yīng)。

為了確定分子開關(guān)的過渡狀態(tài)，研究人員首先評估了激活復(fù)合物（crRNA/激活子）對Cas12a酶的影響。對于固定濃度的Cas12a酶，激活復(fù)合物濃度增加至4 nM以上（保持crRNA：激活子的比例為1:1），Cas12a酶的附屬切割活性顯著提升（圖3B）。通過繪制激活曲線的一階導(dǎo)數(shù)，研究人員將分子開關(guān)分為三組，即開啟、過渡和關(guān)閉（圖3B插圖）。用高濃度的激活復(fù)合物（>8 nM）制作開啟態(tài)CRISPR系統(tǒng)。在響應(yīng)范圍內(nèi)，用中等濃度的激活復(fù)合物制備過渡態(tài)CRISPR系統(tǒng)，并對激活復(fù)合物濃度的變化保持響應(yīng)（即，在Cas12a酶反應(yīng)速率最高的頂點，用5.32 nM的激活復(fù)合物制作高響應(yīng)CRISPR系統(tǒng)）。用低濃度的激活復(fù)合物（<3 nM）制成了封閉狀態(tài)的CRISPR系統(tǒng)。當研究人員通過減少激活子的數(shù)量（即降低增強子：crRNA的比例）來擾亂系統(tǒng)時，處于響應(yīng)狀態(tài)的CRISPR系統(tǒng)顯示出Cas12a酶附屬切割活性的巨大變化（圖3C）。

為了建立過渡態(tài)，研究人員進一步調(diào)整激活子的數(shù)量（即由功能性DNA鎖定，通過觸發(fā)開關(guān)與目標結(jié)合被釋放），同時保持crRNA的數(shù)量不變（圖3D）。通過此優(yōu)化，研究人員將過渡狀態(tài)定義為一階導(dǎo)數(shù)抑制圖（圖3D，插圖）上的頂點。這種被識別的過渡狀態(tài)表明其反應(yīng)性進一步提高，Cas12a酶附屬切割速率最大，而開啟和封閉狀態(tài)CRISPR系統(tǒng)不能產(chǎn)生任何可識別的信號（圖3E）。比例調(diào)節(jié)的Cas12a酶不僅在與互補的目標毒素分子孵育時表現(xiàn)出顯著的附屬切割活性，而且在與非目標分子孵育時也保持低背景活性。針對六種真菌毒素設(shè)計的過渡態(tài)CRISPR系統(tǒng)都實現(xiàn)了更快的激活動力學(xué)。與在其它狀態(tài)下準備的開關(guān)相比，過渡態(tài)CRISPR系統(tǒng)能夠快速激活Cas12a酶。在室溫孵育40 min內(nèi)，可以識別低濃度靶標。

圖3 用于真菌毒素檢測的過渡態(tài)CRISPR系統(tǒng)的建立

壓力驅(qū)動微流控芯片的液體流動測試

微流控芯片上的流體控制是真菌毒素高通量檢測的重要保證。為確定反應(yīng)液在各室的均勻分布，采用添加紅色染料的反應(yīng)液（上方25 μL礦物油）進行流體測試。流道設(shè)計受到自然分形樹系統(tǒng)的啟發(fā)，確保入口施加的壓力均勻分布在腔室上，以引導(dǎo)液體流動的劃分。這種分區(qū)方式的均勻性不受注入過程中壓力變化的影響，保證了100%的分區(qū)效率，利于用戶的友好使用。從圖4中可以看出，紅色液體均勻分布在左右八個檢測室中，并被后續(xù)的礦物油隔離，避免交叉污染。芯片底部設(shè)計的排氣通道利用毛細管效應(yīng)形成一個截止閥，使腔內(nèi)的空氣排出，但液體不能流出。為了保證結(jié)果的準確性，本研究分別采用右側(cè)的2個腔室作為陰性對照和陽性對照，另外6個腔室用于不同真菌毒素的檢測。此外，基于不同分形維數(shù)和分支級別的芯片設(shè)計，該策略可以進一步擴展為更高通量的檢測方案。

圖4 壓力驅(qū)動微流控芯片的組成和整個操作流程

FTMB系統(tǒng)的分析性能

在最佳實驗條件下，F(xiàn)TMB檢測系統(tǒng)中各真菌毒素標準曲線被構(gòu)建。如圖 5A所示，F(xiàn)TMB系統(tǒng)傳感位點的亮度隨著真菌毒素濃度的增加而增加，這并不遵循競爭免疫分析法的原理。FTMB系統(tǒng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制不需要與目標類似物競爭，通過減少信號標記修飾的識別分子的數(shù)量來實現(xiàn)量化。因此，F(xiàn)TMB系統(tǒng)中各位點的熒光強度與目標真菌毒素濃度呈正相關(guān)，這有利于檢測靈敏度的提高。由Michaelis-Menten方程得到的AFB?、OTA、ZEN、FB?、T-2、DON的標準回歸曲線（圖5A）。R2值范圍為 0.949 ~0.989，表明在檢測范圍內(nèi)具有良好的相關(guān)系數(shù)。從標準曲線計算AFB?、OTA、ZEN、FB?、T-2和DON的檢測限（LOD）分別為 2.3 fg/mL、3.9 fg/mL、2.6 fg/mL、1.4 fg/mL、1.7?fg/mL 和 1.5 fg/mL。

為了進一步評估FTMB系統(tǒng)對單一和多重檢測的特異性，F(xiàn)TMB系統(tǒng)對單個AFB?、OTA、ZEN、FB?、T-2、DON及其混合物的熒光響應(yīng)被研究（圖5B）。通過對AFB?、OTA、ZEN、FB?、T-2、DON等6種真菌毒素的單獨檢測，各檢測單元對應(yīng)的目標毒素可觸發(fā)單元內(nèi)的CRISPR反應(yīng)從而恢復(fù)QDs的熒光。檢測單元對非目標毒素無反應(yīng)，信號值與空白對照相似。對于多重檢測，當對多種真菌毒素的不同組合（2-plex、3-plex、4-plex和5-plex）進行測試時，F(xiàn)TMB系統(tǒng)也提供了準確的結(jié)果。在需要制備半抗原的競爭性免疫測定中，某些真菌毒素（如AFB?）在紫外線下的自發(fā)熒光可能會干擾結(jié)果的判讀。而FTMB系統(tǒng)通過觸發(fā)級聯(lián)反應(yīng)發(fā)出熒光，則不受其影響。這些結(jié)果表明，F(xiàn)TMB系統(tǒng)的非競爭性檢測方法能夠準確、特異地檢測出單重或者多重目標毒素。

圖5 FTMB分析性能

綜上所述，該項研究成功開發(fā)了一種基于功能性DNA調(diào)節(jié)和過渡態(tài)CRISPR系統(tǒng)的超敏微流控生物傳感器，可以實現(xiàn)食品中真菌毒素的高通量識別。該傳感器通過設(shè)計的觸發(fā)開關(guān)建立了Cas12a酶的程序化側(cè)枝裂解活性與霉菌毒素濃度之間的正相關(guān)關(guān)系。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，高靈敏度的過渡態(tài)被認為是提高CRISPR/Cas12a系統(tǒng)識別能力的關(guān)鍵因素。調(diào)整Cas12a酶的開放狀態(tài)和關(guān)閉狀態(tài)的比值對FTMB的分析性能有積極的影響。在增強信號方面，通過設(shè)計發(fā)射波段與芯片內(nèi)光子帶隙高度匹配的量子點探針實現(xiàn)了信號顯著增強至45.6倍。該方法不需要對人體和環(huán)境造成生物危害的真菌毒素-蛋白偶聯(lián)物，也不需要制備復(fù)雜、繁瑣的抗體。為了進一步提高用戶友好性，F(xiàn)TMB系統(tǒng)的微流體平臺可以與自動化液體處理系統(tǒng)或者手動進樣兼容。FTMB通過樣品擴展和系統(tǒng)自動化，在真菌毒素殘留物聯(lián)合檢測方面具有廣闊的應(yīng)用前景，可為食品的安全性評價和質(zhì)量控制提供新的技術(shù)支持。

審核編輯：劉清