人眼可以看見物體,是因?yàn)檠劬χ芯铙w收集了物體發(fā)出的光線并將這些光線匯聚在視網(wǎng)膜上進(jìn)行了成像,如太陽、電燈和螢火蟲等。對于不發(fā)光且不透明的物體,通過其表面反射光線成像,物體對不同波長的吸收不同會呈現(xiàn)出不同的顏色。對不發(fā)光的透明物體來說,因?yàn)榕c周圍介質(zhì)的折射率存在差異,在兩者界面上會產(chǎn)生反射與折射,通過反射光或透射光與背景的差異就看到了物體。在常見的物質(zhì)中,空氣的折射率約為1、水的折射率約為1.33、普通玻璃的折射率為1.5,將玻璃片置于空氣中時較容易被看到,而將其放入水中時就較難被看到了,這是由于玻璃片與水的折射率比較接近,光在兩者界面產(chǎn)生的反射和折射現(xiàn)象不是很明顯,因此不易被觀察到。若玻璃片與周圍介質(zhì)的折射率更接近就沒辦法被看到了。
圖1 玻璃片在空氣和水中的情況 折射率相近導(dǎo)致物體不易被觀察到的情況在顯微成像中也是經(jīng)常遇到的問題。顯微鏡的發(fā)明與使用對生命科學(xué)的發(fā)展具有劃時代的意義,若沒有它,人類對生物的認(rèn)識只能停留在人眼可見的水平,不能深入到微觀世界,也不能對一些生命現(xiàn)象進(jìn)行科學(xué)解釋,更不能對生命現(xiàn)象進(jìn)行合理利用和干預(yù)。在生命科學(xué)的研究領(lǐng)域中,想要深入了解細(xì)胞、組織或器官內(nèi)的生命活動過程就需要先對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和組織進(jìn)行深入了解,這些樣本多數(shù)為無色透明,在明場照明顯微鏡下很難清晰地觀測其微細(xì)結(jié)構(gòu)。為了可以看到這些樣本的更多細(xì)節(jié),科學(xué)家們也是煞費(fèi)苦心。
染色和染料常在生物學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域被用于提高生物組織的可見度,同樣,熒光探針標(biāo)記也具有類似的用途,但是兩種方式在進(jìn)行顯微觀察時都需要對樣本進(jìn)行預(yù)處理,這個過程繁雜且會破壞樣本的生理狀態(tài)。隨著需求的日益增加,一種簡潔且可研究細(xì)胞正常生命周期的相差顯微系統(tǒng)就誕生了!
相差顯微鏡最早是由荷蘭物理學(xué)家Frits Zernike提出的,它是一種可增強(qiáng)樣本與背景對比度的顯微成像系統(tǒng)(如圖2所示),在不對透明樣本進(jìn)行染色處理的情況下可獲得如活細(xì)胞、微生物、薄組織切片等透明樣本的高對比度圖像。
圖2 相差顯微鏡
在介紹相差顯微鏡的工作原理前先來了解明場顯微鏡是如何工作的:當(dāng)照明光通過生物標(biāo)本時,由于細(xì)胞各部位細(xì)微結(jié)構(gòu)的折射率和厚度的不同,樣本對光的吸收程度不同,在顯微鏡視場中就可見到明暗度不同的各物點(diǎn)圖像,這是由光的振幅不同所致,即相機(jī)采集到的是光強(qiáng)信息。但是如果樣本中需要觀察的物點(diǎn)近乎透明,視場中就看不出明顯的灰度差別。但是光波在通過各種物點(diǎn)時會發(fā)生衍射和折射,使得通過的光波因延遲而發(fā)生了偏離,其光程就有了一定的差別,即產(chǎn)生了所謂“相位差”。人眼不能分辨這種相位差,但可以設(shè)法將相位差轉(zhuǎn)換成振幅差。相差顯微鏡就是利用光的干涉原理,是將相位的微小變化轉(zhuǎn)換成相應(yīng)振幅變化的顯微觀察裝置。
接下來介紹一下相差顯微鏡是如何將這種相位變化轉(zhuǎn)換為振幅變化的。圖3為常見的使用臨界照明方式的明場顯微成像光路,平行光束經(jīng)過聚光鏡后會聚于樣本平面進(jìn)行照明,樣本各區(qū)域?qū)獾奈粘潭炔煌?,所以在顯微鏡視場中可見到明暗度不同的各物點(diǎn)圖像。
圖3 明場顯微成像光路
圖6為相差顯微系統(tǒng)的基礎(chǔ)光路圖,與圖3進(jìn)行對比可以發(fā)現(xiàn),相差顯微系統(tǒng)的光路就是在臨界照明的明場照明顯微系統(tǒng)的基礎(chǔ)上增加了一個環(huán)形的光闌和一個環(huán)形的相位板,這兩個器件也就是相差顯微系統(tǒng)的核心器件。環(huán)形光闌的作用是產(chǎn)生中空的環(huán)形光,不同的環(huán)狀孔形成的光闌,它們的直徑和孔寬是與不同的物鏡相匹配的,透明圓環(huán)所成的像恰好落在物鏡后焦面與相板上的共軛面重合;相位板安裝在物鏡的后焦面處,相位板裝有吸收光線的吸收膜和推遲相位的相位膜,它除了能推遲直射光線或衍射光的相位以外,還有吸收光使亮度發(fā)生變化的作用。
圖4 環(huán)形光闌和相位板
如圖5和圖6所示,當(dāng)入射照明光通過樣本后,部分光會發(fā)生衍射偏離原來路徑(如圖5左側(cè)光線所示,圖6中綠色區(qū)域表示被物鏡收集的衍射光),但是大部分的入射光不發(fā)生衍射而是沿著原來路徑傳播(圖5中物鏡后的橙色區(qū)域),未發(fā)生衍射的光經(jīng)過相位環(huán)的衰減后在相機(jī)上形成平面背景。而偏離原來路徑的衍射光在經(jīng)過相位環(huán)后會發(fā)生一個90°的相移,經(jīng)過相移的衍射光和未衍射光最終在相機(jī)上形成干涉圖樣,并將物體的相位信息轉(zhuǎn)化為光強(qiáng)信息記錄下來。
圖5 照明光照射樣本后的衍射情況
圖6 相差顯微光路
根據(jù)基礎(chǔ)的相差顯微系統(tǒng)光路以及多軸籠式結(jié)構(gòu)的特點(diǎn),對基礎(chǔ)的相差顯微光路進(jìn)行修改(如圖7),然后使用多軸籠式結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)器件根據(jù)光路完成實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的搭建(如圖8)。
圖7 系統(tǒng)光路
圖8 系統(tǒng)實(shí)物
選擇口腔上皮細(xì)胞、蛙卵單細(xì)胞和蘚精子器切片這些樣本作為實(shí)驗(yàn)樣本,使用相同的放大倍率分別采集同一區(qū)域的明場圖像和相差圖像(如圖10所示)。
圖9 測試樣品
圖10 樣本的明場圖像(左)與相差圖像(右) a、b:口腔上皮細(xì)胞;c、d:蛙卵單細(xì)胞;e、f:蘚,精子器切片。
通過明場圖像與相差圖像的對比可發(fā)現(xiàn),在相差顯微觀察中可以看到一些在明場顯微觀察中無法看清的細(xì)節(jié),
注意:必須調(diào)節(jié)光闌的亮環(huán)和相位板的環(huán)狀圈重合,才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能。否則直射光或衍射光的光路紊亂,應(yīng)被吸收的光不能吸收,該延遲相位的光波不能延遲,就失去了相差顯微鏡的作用。另外,相差顯微鏡的局限在于不適合厚度大的樣品,一般以5-10μm為宜。
圖11 光闌與相位板不同位置對圖像的影響
審核編輯 :李倩
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原文標(biāo)題:透明樣本的成像工具-相差(相襯)顯微鏡
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