病原菌的檢測對于預(yù)防和治療感染以及保障食品安全至關(guān)重要。目前的金標(biāo)準(zhǔn)檢測技術(shù),例如培養(yǎng)基檢測和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR),不僅耗時,并且還需要集中在實驗室進(jìn)行。因此,人們致力于開發(fā)快速、廉價、便攜且不需要專門培訓(xùn)的即時檢測(POC)裝置?;诩垙埖姆治鲅b置恰好滿足上述標(biāo)準(zhǔn),特別適合在資源匱乏的環(huán)境中部署。
據(jù)麥姆斯咨詢報道,近日,新南威爾士大學(xué)(The University of New South Wales,UNS)化學(xué)工程學(xué)院和澳大利亞納米醫(yī)學(xué)中心(Australian Centre for Nanomedicine,ACN)的研究人員在Nature Reviews Bioengineering期刊上發(fā)表了一篇題為“Paper-based sensors for bacteria detection”的綜述文章,他們討論了紙基細(xì)菌檢測平臺,不包括如病毒、寄生蟲和真菌等其它微生物病原體。
重要的是,目前,只有滿足(或接近滿足)以下標(biāo)準(zhǔn)的健康診斷、食品質(zhì)量控制和環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域的研究被包含在內(nèi):傳感器可以評估未經(jīng)處理或未加工的樣品,在資源匱乏的環(huán)境中滿足可現(xiàn)場部署即時檢測的REASSURED標(biāo)準(zhǔn),并在相關(guān)實際范圍內(nèi)達(dá)到檢測限(LOD)。對于后一個標(biāo)準(zhǔn),重點將放在實現(xiàn)小于102菌落形成單位(CFU)?/ml的低檢測限。同時,研究人員總結(jié)了紙基細(xì)菌檢測平臺面臨的主要挑戰(zhàn)。
注:REASSURED是Real-time connectivity, Ease of specimen collection, Affordable, Sensitive, Specific, User-friendly, Rapid/Robust, Equipment-free and Deliverable首字母縮寫。
紙基傳感技術(shù)發(fā)展時間線
紙基傳感平臺
紙基傳感器的一個重要特點是,其可以通過毛細(xì)管流動自發(fā)地輸送液體,因此不需要泵。此外,紙基傳感器易于調(diào)節(jié)紙張孔徑,以改變流速,并且紙張具有高的表面積與體積比,可使試劑固定和儲存。最受歡迎的紙基傳感平臺是基于比色法的橫向流動分析(LFA)。通常,橫向流動分析由樣品墊、共軛墊、檢測墊和吸收墊等組成。
商用紙基傳感器
針對標(biāo)準(zhǔn)的夾心免疫測定,首先需將樣品引入樣品墊以啟動吸收過程。然后樣品移向共軛墊,與標(biāo)記的檢測生物受體(通常是納米粒子偶連的抗體)相互作用。在進(jìn)一步遷移后,樣品到達(dá)檢測墊,檢測墊包含一條測試線(捕獲的生物受體與標(biāo)記的分析物結(jié)合),以及一條對照線。最后,吸收墊吸收多余的樣品,并規(guī)定測試所需的樣品體積。紙基微流控分析裝置遵循類似的機制,并受益于簡單的設(shè)計、低廉的成本和5~30分鐘的快速響應(yīng)時間,具體取決于樣品特性和應(yīng)用場景。相比之下,盡管敏感性相當(dāng),基于電化學(xué)的技術(shù)研究卻有所下降,可能由于其成本較高。
研究人員注意到,不同的應(yīng)用需要不同的采樣方法(破壞性或非破壞性)、質(zhì)量保證和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。例如,在固態(tài)食物樣品中,病原體不像在液態(tài)樣品中分布的那樣均勻。本文中,研究人員將嚴(yán)格滿足使用未加工樣品、即時檢測適用性和證明相關(guān)檢測限標(biāo)準(zhǔn)的研究,根據(jù)樣品的固體、液體和氣體狀態(tài)對其進(jìn)行分組。該應(yīng)用將從臨床診斷到食品和環(huán)境中的病原體檢測。
紙基傳感器的操作過程
固態(tài)樣品
用于固態(tài)樣品(如牛肉、海鮮、面包和生菜)中細(xì)菌檢測的紙基傳感平臺大多是基于比色的橫向流動分析。這些傳感器對用戶很友好,適用于資源匱乏環(huán)境中的即時檢測應(yīng)用。研究人員基于橫向流動分析結(jié)合擴增技術(shù)設(shè)計了幾種平臺,例如用于細(xì)菌檢測的聚合酶鏈反應(yīng)、表面增強拉曼光譜(SERS)或免疫磁性分離(IMS)等平臺。他們還開發(fā)了使用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)或紙基酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的其它方法。然而,此類方法需要加熱,并且需集中在實驗室處理,同時需要多個處理步驟,盡管該類系統(tǒng)更加復(fù)雜,但其靈敏度并不比簡單的替代方案低多少(102~10?菌落形成單位/ml)。
雖然CRISPR-Cas紙基細(xì)菌檢測分析受益于固態(tài)樣品的低檢測限(1~102菌落形成單位/ml),但它們需要重組酶聚合酶擴增(RPA)或重組酶輔助擴增(RAA)方法。這些步驟需在37°C~42°C間進(jìn)行,與環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的60°C相比,更接近室溫,然而,仍需要電源。此外,擴增組分(如Cas蛋白和引物)需要儲存在遠(yuǎn)低于冰點的溫度(零下20?°C)下,這意味著基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增和基于CRISPR的方法在其當(dāng)前狀態(tài)下,并不符合所有的REASURED標(biāo)準(zhǔn)。
液態(tài)樣品
與固態(tài)樣品類似,針對液態(tài)樣品(如血清、牛奶、水、果汁和嬰兒配方奶粉溶液)中的細(xì)菌,研究人員主要使用基于橫向流動分析的比色法檢測,因其簡單易行。其中大多數(shù)分析依賴于金納米顆粒作為信號探針,但它們受到高檢測限的限制(大于103菌落形成單位/ml?),或需要樣品預(yù)處理的限制。為了提高其性能,基于橫向流動的分析已與磁性納米顆粒等擴增方法相結(jié)合,以實現(xiàn)目標(biāo)分析物(例如顯色物質(zhì)和酶)預(yù)濃縮,或?qū)嵤┚酆厦告湻磻?yīng)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增以及基于CRISPR-Cas的方法。然而,這些方法都受到以下一個或多個因素限制,例如高溫、長響應(yīng)時間、低靈敏度、大量樣品制備和擴增步驟等。
氣態(tài)樣品
在空氣懸浮液中也可以發(fā)現(xiàn)細(xì)菌,將其稱為生物氣溶膠。由于樣品的性質(zhì),分析通常包括兩個主要步驟:收集和檢測。收集可通過沉淀、過濾、離心、沖擊、撞擊或微流控芯片實現(xiàn)。例如,帶有細(xì)菌的空氣樣品可以通過紙基裝置上的多孔采樣墊。然后在取樣墊上使用干燥的裂解緩沖液裂解收集到的細(xì)菌,釋放DNA分子,然后通過水介導(dǎo)的側(cè)向流將其輸送至結(jié)合墊。這種測定的一個限制是,需要使用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)分析得到的等分試樣。
總而言之,紙基分析平臺的簡單性和低成本引發(fā)了大量關(guān)于細(xì)菌檢測的研究。與電化學(xué)、熒光或化學(xué)發(fā)光方法相比,大部分此類裝置使用比色法作為分析技術(shù)。這種基于紙張的診斷工具在即時檢測應(yīng)用方面具有巨大潛力,但為了滿足REASSURED標(biāo)準(zhǔn),仍有幾個關(guān)鍵挑戰(zhàn)需要解決。特別是,考慮到特定的細(xì)菌和應(yīng)用,需要改進(jìn)檢測限。選擇性可以通過對樣品中經(jīng)常存在的目標(biāo)化合物的干擾實驗來解決,例如,對于臨床診斷,應(yīng)使用微生物群落背景和血清蛋白作為對照。在食品樣品中,氨基酸、蛋白質(zhì)和脂肪酸會干擾測定,而在農(nóng)業(yè)樣品中,土壤和植物蛋白質(zhì)會影響測定。
此外,大多數(shù)研究通常評估其平臺對其它致病菌的選擇性。評估屬或菌株水平的選擇性以減少假陽性結(jié)果也很重要。細(xì)菌對環(huán)境或物理壓力的反應(yīng)會導(dǎo)致其表型狀態(tài)或代謝活性的變化。因此,未來的研究,特別是那些依賴代謝釋放的副產(chǎn)物(如揮發(fā)性有機化合物(VOC)和抗微生物菌株)的研究,必須定期校準(zhǔn),以明確這些變化,避免檢測錯誤。此外,為了確保測量的準(zhǔn)確性,需要考慮蛋白質(zhì)水平、粘度和pH值。
審核編輯:劉清
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原文標(biāo)題:綜述:用于細(xì)菌檢測的紙基傳感器
文章出處:【微信號:MEMSensor,微信公眾號:MEMS】歡迎添加關(guān)注!文章轉(zhuǎn)載請注明出處。
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