虹科案例|基于SOLA光源的高通量Spike展示平臺(tái)加速新冠病毒疫苗研制

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背景提要

自21世紀(jì)初以來(lái)，三種冠狀病毒已越過(guò)物種壁壘，導(dǎo)致人類(lèi)致命的肺炎：嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）冠狀病毒（SARS-CoV）、中東呼吸綜合征（MERS）冠狀病毒（MERS-CoV）和SARS-CoV-2（之前稱(chēng)為2019年新型冠狀病毒, 2019-nCoV）。

SARS-CoV于2002年在中國(guó)廣東省出現(xiàn)，并通過(guò)航空旅行路線傳播到五大洲，感染8098人，造成774人死亡。2012年，MERS-CoV出現(xiàn)在阿拉伯半島，并傳播到27個(gè)國(guó)家，共感染約2494人，并奪走了858人的生命。如今，它仍然是阿拉伯半島的一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。2019年12月在中國(guó)湖北省武漢市發(fā)現(xiàn)了一種以前未知的冠狀病毒SARS-CoV-2（簡(jiǎn)稱(chēng)新冠病毒），目前已經(jīng)是國(guó)際范圍關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件。

冠狀病毒的刺突糖蛋白（Spike ）示意圖

冠狀病毒的刺突糖蛋白（Spikeglycoprotein,S glycoprotein）是Ⅰ型跨膜糖蛋白，也是病毒最大的結(jié)構(gòu)蛋白，其包含了病毒的主要抗原決定簇，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和介導(dǎo)免疫反應(yīng)，通常包括由球狀的受體結(jié)合亞基S1和棒狀的融合亞基S2兩部分。同時(shí)，S蛋白的S1亞基決定了受體細(xì)胞的表面受體的特異性，而S2亞基又決定了病毒進(jìn)入細(xì)胞的融合過(guò)程的特性，可以說(shuō)Spike蛋白的結(jié)構(gòu)對(duì)于設(shè)計(jì)疫苗來(lái)產(chǎn)生抗體或者設(shè)計(jì)藥物阻斷病毒吸附與侵染具有重要作用。

冠狀病毒Spike蛋白暴露于病毒表面并介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，因此它是感染后中和抗體的主要靶標(biāo)，也是藥物開(kāi)發(fā)和疫苗設(shè)計(jì)的重點(diǎn)。對(duì) Spike 糖蛋白的體液免疫是抵抗 SARS-CoV-2 的最有效手段。SARS-CoV-2 疫苗通過(guò)免疫接種可產(chǎn)生強(qiáng)烈的多克隆抗體反應(yīng)。Spike 還是預(yù)防和治療中和性單克隆抗體（中和抗體）和 ACE2 結(jié)合抑制劑的主要靶標(biāo)。但是，Spike 突變和重組，使它們部分逃避了單克隆抗體，恢復(fù)期的血清和疫苗誘導(dǎo)的體液免疫。

新病毒變異體的抗原性和感染性通常通過(guò)活病毒，假型病毒和動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定。這些分析的通量低，需要冗長(zhǎng)的病毒準(zhǔn)備工作，這大大影響了Spike蛋白變體表達(dá)的研究以及疫苗研制的效率。

02

基于SOLA光源的

高通量Spike展示平臺(tái)

針對(duì)新冠病毒多變體測(cè)量步驟多、分析通量低的現(xiàn)狀，目前迫切需要一種高通量平臺(tái)能夠測(cè)定數(shù)百種Spike 糖蛋白變體表達(dá)、受體結(jié)合和抗體逃逸的情況。德克薩斯大學(xué)的一組研究人員最近報(bào)告了Spike展示平臺(tái)技術(shù)的發(fā)展。他們開(kāi)發(fā)了一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面 Spike 展示技術(shù)，這是一個(gè)高通量的平臺(tái)，該平臺(tái)可測(cè)量哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面上的變體 Spike 同源三聚體的表達(dá)、受體結(jié)合和抗體逃逸，還可以快速表征跨多個(gè)冠狀病毒家族蛋白的糖基化 spike 胞外域。研究者預(yù)計(jì)，spike 展示將加速 SARS-CoV-2 和其他新興病毒的抗原設(shè)計(jì)、深層掃描突變和抗體表位作圖，以幫助目前和未來(lái)的大流行對(duì)策。

Spike展示平臺(tái)使spike糖蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)基因表達(dá)成為可能。Spike糖蛋白用附加的3X FLAG標(biāo)簽和蛋白酶切割和親和純化位點(diǎn)表示。作為平臺(tái)驗(yàn)證的一部分，研究人員使用高性能的SOLA光源進(jìn)行雙色免疫熒光顯微鏡檢查，以確認(rèn)SARS-CoV-2 Spike的細(xì)胞膜定位以及蛋白質(zhì)ACE2，REGN10933和4A8的結(jié)合（圖1）。使用Spike展示平臺(tái)，該團(tuán)隊(duì)通過(guò)中和抗體測(cè)定了約200個(gè)SARS-CoV-2刺突變體的表達(dá)，ACE2結(jié)合和和 13 個(gè) nAb 的識(shí)別，證明了Spike展示平臺(tái)在加速疫苗研制和快速評(píng)估突變對(duì)新興病毒變體的方面的巨大潛力。

圖 1. SARS-CoV-2 Spike糖蛋白在人胚胎腎 (HEK293T) 細(xì)胞表面定位的免疫熒光顯微鏡驗(yàn)證。在使用 SOLA 光源照明的 NikonTs2R-FL 顯微鏡上使用 60 倍放大率獲取的圖像。綠色熒光表示表達(dá)水平。紅色熒光表明 ACE2 與中和抗體 REGN10933 和 4A8 結(jié)合。藍(lán)色熒光表示由 Hoechst 33342 進(jìn)行的核染色。

在這里，SOLA光源代替了顯微鏡成像技術(shù)中常用的傳統(tǒng)汞弧燈，具有明顯優(yōu)勢(shì)。首先，傳統(tǒng)的汞燈或金屬鹵素?zé)粼诠ぷ髦袝?huì)揮發(fā)出有害物質(zhì)汞，從而對(duì)環(huán)境造成危害。而SOLA光源是4-6個(gè)固態(tài)光源同時(shí)工作，在穩(wěn)定輸出白光的同時(shí)不會(huì)揮發(fā)有害物質(zhì)，屬于綠色清潔可持續(xù)性的技術(shù)。此外，汞燈發(fā)光效率不高且使用壽命較短，維修或更換燈泡會(huì)耽誤許多工作進(jìn)程。數(shù)據(jù)表明，一個(gè)固態(tài)光源的壽命相當(dāng)于15-150個(gè)含汞燈泡。相比之下，虹科SOLA固態(tài)光源不僅消除了潛在的汞危害，同時(shí)能夠提供高性能照明，高數(shù)據(jù)質(zhì)量，且大大降低了使用成本。

德克薩斯大學(xué)研究人員開(kāi)發(fā)的這種利用SOLA光源的Spike 展示技術(shù)，預(yù)計(jì)可以適應(yīng)各種冠狀病毒家族的 Spike 糖蛋白和其他病毒抗原。Spike 展示平臺(tái)可以從細(xì)胞表面切出 Spike，以進(jìn)行結(jié)構(gòu)和生物物理表征；可補(bǔ)充用于高分辨率表位作圖的結(jié)構(gòu)功能研究；加快抗體 -Spike 相互作用的表征，同時(shí)對(duì)所有可能的氨基酸取代進(jìn)行深度突變掃描將廣泛用于表征 Spike 突變情況以及泛冠狀病毒疫苗抗原的開(kāi)發(fā)。從 Golden Gate 裝配到表征的整個(gè)過(guò)程都可以在 5 天內(nèi)完成，將加速疫苗設(shè)計(jì)并快速評(píng)估新興病毒株中突變的影響。

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SOLA光源介紹

虹科系列SOLA光源是顯微鏡和其他生命科學(xué)應(yīng)用中現(xiàn)代固態(tài)照明的市場(chǎng)領(lǐng)導(dǎo)者，是傳統(tǒng)汞弧燈與金屬鹵素?zé)舻闹苯犹娲摺?/strong>

SOLA光源系列的光譜輸出與SOLA實(shí)物圖
該產(chǎn)品線現(xiàn)在包括4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)型號(hào)，這些型號(hào)通過(guò)光源數(shù)量和光譜輸出進(jìn)行區(qū)分：SOLA，SOLA FISH，SOLA U-nIR和SOLA V-nIR光源。SOLA 光源為激發(fā) DAPI、GFP/FITC、YFP、Cy3、mCherry、Cy5 和光譜相似的熒光團(tuán)提供白光輸出。在SOLA FISH光源中，475-600nm區(qū)域的輸出被紅移，為SpectrumGreenTM，SpectrumRedTM和其他通常用于細(xì)胞遺傳學(xué)測(cè)試實(shí)驗(yàn)室中熒光原位雜交（FISH）分析的熒光團(tuán)提供最佳激發(fā)。SOLA V-nIR 和 U-nIR 光引擎提供最廣泛的光譜覆蓋范圍，包括用于激發(fā) Cy7 和 ICG 等熒光團(tuán)的近紅外 （nIR） 輸出，以及受益于 nIR 光增強(qiáng)的組織穿透力的其他應(yīng)用。目前，更新的SOLA 光源產(chǎn)品線都增加了主動(dòng)光輸出穩(wěn)定、全線性強(qiáng)度控制和電子控制接口。SOLA光源不含任何需要更換或校準(zhǔn)的部件，不需要日常維護(hù)，典型的工作壽命為10年，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)任何燈泡。所有SOLA固態(tài)光源都不含汞，符合RoHS標(biāo)準(zhǔn)。