便攜式集成微流控生物芯片用于B組鏈球菌快速診斷

B組鏈球菌（Group B Streptococcus, GBS）是產(chǎn)后感染和新生兒感染中重要病原菌之一。特別是在妊娠過程中，可導(dǎo)致孕婦的早產(chǎn)、宮內(nèi)感染等并發(fā)癥；在分娩期間也可能會導(dǎo)致新生兒敗血癥、腦膜炎或肺炎等一系列感染，是全球新生兒侵襲性感染的主要原因。每年導(dǎo)致9.1萬名新生兒死亡，4.6萬多名死產(chǎn)和4萬名感染后患有神經(jīng)殘疾的新生兒。因此，快速準(zhǔn)確地診斷孕婦GBS對預(yù)防新生兒感染至關(guān)重要。對于城市或者城鎮(zhèn)醫(yī)院，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了基于規(guī)范化的實(shí)驗(yàn)室的GBS普篩。但對于資源有限的偏遠(yuǎn)鄉(xiāng)村地區(qū)的衛(wèi)生院及婦幼保健院，由于缺乏訓(xùn)練有素的技術(shù)人員，以及額外的、高成本的儀器，GBS的快速診斷存在諸多挑戰(zhàn)。

據(jù)麥姆斯咨詢報(bào)道，針對上述需求，北京航空航天大學(xué)常凌乾課題組在《Biosensors ＆ Bioelectronics》（IF: 12.7）期刊上發(fā)表了題為“A portable, integrated microfluidics for rapid and sensitive diagnosis of streptococcus agalactiae in resource-limited environments”的研究文章，設(shè)計(jì)了一種便攜式集成微流控生物芯片，可以快速提取樣本拭子中的DNA，并進(jìn)行快速擴(kuò)增，最后通過試紙條可視化的讀取結(jié)果，整個(gè)流程控制在40分鐘以內(nèi)。與傳統(tǒng)的NAAT（6小時(shí)）不同，該平臺是一種簡單、便攜、無電源的微流控平臺，僅通過簡單的手指擠壓操作，即可在1小時(shí)內(nèi)完成DNA提取、富集、純化、擴(kuò)增和檢測的整個(gè)過程，因此非常適合中心實(shí)驗(yàn)室以外的各種場景。

作為革蘭氏陽性菌，GBS具有特有的細(xì)胞壁和莢膜結(jié)構(gòu)，給傳統(tǒng)DNA提取方法帶來了額外的挑戰(zhàn)。針對此，研究人員設(shè)計(jì)了一步法DNA提取管，用PDMS隔片將提取管分成兩個(gè)獨(dú)立的區(qū)域，分別裝載樣本稀釋液和核酸裂解液。在操作中，被試者將取樣拭子放入稀釋液中釋放病原體，然后輕輕撥動(dòng)PDMS隔片，使稀釋劑流向下方含有玻璃珠的裂解液。通過簡單地用手搖動(dòng)提取管，并在提供的便攜式加熱裝置中加熱10分鐘，即可釋放DNA。

生物芯片平臺由三個(gè)功能區(qū)組成，包括DNA富集區(qū)、DNA擴(kuò)增區(qū)和檢測區(qū)。通過使用設(shè)計(jì)的彈性軟管，擠壓軟管產(chǎn)生顯著的驅(qū)動(dòng)力，將預(yù)包裝的相應(yīng)緩沖液，包括裂解緩沖液(A-軟管)、洗滌緩沖液(B-軟管)、RPA緩沖液(C-軟管)、運(yùn)行緩沖液(D-軟管)分別推入設(shè)備中的相應(yīng)部位，產(chǎn)生不同的功能。在操作時(shí)擠壓A-軟管，驅(qū)動(dòng)含有GBS DNA的液體流入富集區(qū)，DNA被預(yù)先填充的磁珠捕獲。并且，磁珠被生物芯片下面的磁鐵捕獲，使DNA固定在擴(kuò)增區(qū)。其余的液體被收集在廢液池中；第二步，擠壓B-軟管，洗滌去除磁珠表面的雜質(zhì)(包括各種蛋白質(zhì)和離子)；第三步，擠壓C-軟管，使RPA緩沖液進(jìn)入擴(kuò)增區(qū)，在38℃下進(jìn)行快速擴(kuò)增；最后，擠壓D-軟管，將擴(kuò)增溶液驅(qū)動(dòng)到試紙條上，以讀出結(jié)果。在試紙條上，在檢測線（T線）上修飾鏈霉親和素，在質(zhì)控線（C線）上修飾二抗，可以捕獲RPA體系中特異性探針的生物素和FAM基團(tuán)，與膠體金形成“三明治”結(jié)構(gòu)，顯示紅色條帶，表示陽性反應(yīng)。

圖1 用于GBS快速診斷的生物芯片的設(shè)計(jì)理念和運(yùn)行過程的原理示意圖

考慮到這樣一個(gè)簡單、便攜、可重復(fù)使用的設(shè)備可以用于中心實(shí)驗(yàn)室以外的場景，該課題組設(shè)計(jì)了一個(gè)可重復(fù)使用的便攜式加熱裝置作為平臺附件。該裝置由4根彈性軟管組成，軟管內(nèi)裝有相應(yīng)的緩沖液(裂解緩沖液、洗滌緩沖液、RPA緩沖液、運(yùn)行緩沖液)，依次完成核酸提取、富集/純化、擴(kuò)增和讀出過程。核心加熱功能由電池供電，控制加熱板，單次反應(yīng)持續(xù)加熱約40分鐘，分別用于DNA提取的95℃，和RPA反應(yīng)的38℃。

研究團(tuán)隊(duì)在中國甘肅省婦幼保健院（甘肅省中心醫(yī)院）進(jìn)行了47例患者的陰道和肛門拭子樣本檢測。通過比較qPCR實(shí)驗(yàn)室結(jié)果與PIM平臺的顯色反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)qPCR結(jié)果與新技術(shù)具有相同的靈敏度。最終，47例臨床樣本顯示，平臺靈敏度達(dá)到100%，與臨床PCR結(jié)果一致。

圖2 在臨床診斷中的應(yīng)用

該研究通訊作者為北航生物醫(yī)學(xué)工程常凌乾教授、甘肅省中心醫(yī)院易彬教授、甘肅省腫瘤醫(yī)院蘇海翔教授。第一作者是北航博士生王之瑩，甘肅省中心醫(yī)院晏博博士、倪亞莉主任為共同第一作者。

審核編輯：劉清