基于磁性探針的級(jí)聯(lián)相轉(zhuǎn)移微流控芯片用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)

癌癥作為全球第二大死因，每年導(dǎo)致約1千萬(wàn)人死亡。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）是指從原發(fā)腫瘤病灶脫落并進(jìn)入外周血液循環(huán)的各類腫瘤細(xì)胞，被認(rèn)為是癌癥轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志物。CTCs在腫瘤早期就已出現(xiàn)，并攜帶腫瘤大量的實(shí)時(shí)信息，因此CTCs檢測(cè)在癌癥研究中受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注。然而，由于血液中CTCs數(shù)量極少，1mL全血中僅含有1 ~ 10個(gè)CTCs，高效分離并準(zhǔn)確測(cè)定全血樣品中的CTCs存在巨大困難。近年來(lái)，微流控芯片技術(shù)已發(fā)展成為一種極具潛力的從血液中分選富集CTCs的技術(shù)。CTCs分選性能在很大程度上取決于芯片的設(shè)計(jì)，因此，設(shè)計(jì)并搭建分選性能優(yōu)異、操作簡(jiǎn)便的微流控芯片平臺(tái)至關(guān)重要。

近期，武漢大學(xué)胡斌教授課題組報(bào)道了一種基于磁性探針的級(jí)聯(lián)相轉(zhuǎn)移多功能微流控芯片平臺(tái)，通過(guò)與電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）聯(lián)用，成功實(shí)現(xiàn)CTCs的高活性分選、純化、釋放和定量檢測(cè)，相關(guān)成果以“ACascaded Phase-Transfer Microfluidic Chip with Magnetic Probe for High-ActivitySorting, Purification, Release, and Detection of Circulating Tumor Cells”為題發(fā)表在國(guó)際化學(xué)權(quán)威雜志AnalyticalChemistry上。

研究人員構(gòu)建了一個(gè)多功能級(jí)聯(lián)相轉(zhuǎn)移微流控芯片平臺(tái)，該芯片集被動(dòng)分選和主動(dòng)分選于一體，主要由分選區(qū)、純化區(qū)和釋放區(qū)三個(gè)功能區(qū)組成。實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示，CTCs在微流控芯片中經(jīng)歷分選、純化和釋放，之后引入ICP-MS檢測(cè)實(shí)現(xiàn)對(duì)其的準(zhǔn)確定量。首先，將EpCAM適配體修飾的磁球與去除紅細(xì)胞的血液樣品共孵育一段時(shí)間，實(shí)現(xiàn)磁性探針對(duì)CTCs的識(shí)別和捕獲，隨后將其從入口樣品處引入芯片。在細(xì)胞分選區(qū)域，CTCs在中心強(qiáng)磁場(chǎng)和螺旋通道的共同作用下，迅速?gòu)膶挿植紶钸w移至通道內(nèi)壁，并沿著內(nèi)側(cè)從第一個(gè)分選口處進(jìn)入細(xì)胞純化區(qū)，此時(shí)大量血細(xì)胞則從出口1流出，實(shí)現(xiàn)CTCs的初步分選。同時(shí)，另一入口通入的PBS緩沖液將與進(jìn)入純化區(qū)的CTCs樣品流形成穩(wěn)定的層流，CTCs在磁力和流體動(dòng)力的共同作用下，從樣品流相轉(zhuǎn)移至PBS緩沖液中，而剩余血細(xì)胞則保持在原樣品流中從出口2流出，完成CTCs的進(jìn)一步純化。核酸酶溶液從核酸酶入口處通入，與含有CTCs的PBS流在釋放區(qū)形成穩(wěn)定的層流。在鋸齒狀的芯片結(jié)構(gòu)和矩形磁鐵的磁場(chǎng)作用下，CTCs再次相轉(zhuǎn)移至酶溶液中，并在強(qiáng)磁場(chǎng)作用下被固定在鋸齒凹槽內(nèi)。此時(shí)，持續(xù)流動(dòng)的酶溶液不斷酶解磁球與細(xì)胞之間連接的適配體，最終磁球留在鋸齒凹槽內(nèi)，而細(xì)胞從磁球上脫離后則隨酶溶液從出口3流出，實(shí)現(xiàn)溫和的CTCs釋放。將CTCs收集，可用于后續(xù)ICP-MS定量檢測(cè)或再培養(yǎng)等下游分析。

圖1 級(jí)聯(lián)相轉(zhuǎn)移多功能微流控芯片的設(shè)計(jì)及CTCs捕獲、分選、純化、釋放和ICP-MS檢測(cè)原理圖

隨后，研究人員分別考察了CTCs分選純化區(qū)芯片和CTCs釋放區(qū)芯片的可行性。將磁性探針結(jié)合的CTCs和含有紅色墨水的PBS緩沖液分別引入分選純化區(qū)芯片，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞在芯片中的遷移，結(jié)果如圖2A ~ 2C所示。在第一個(gè)分選口處、相轉(zhuǎn)移過(guò)程中和第二個(gè)分選口處，均能觀察到CTCs沿著預(yù)設(shè)的路徑發(fā)生轉(zhuǎn)移，并最終從目標(biāo)出口流出，表明分選純化區(qū)的設(shè)計(jì)可行。同樣地，將磁性探針結(jié)合的且Hoechst預(yù)染色的CTCs和核酸酶溶液分別從兩個(gè)入口引入釋放區(qū)芯片，如圖2D ~ 2G所示，可以觀察到凹槽內(nèi)的CTCs先迅速積累，隨后逐漸被釋放，且目標(biāo)出口所收集到的CTCs表面并未觀察到明顯的磁性顆粒，表明芯片釋放區(qū)可以成功實(shí)現(xiàn)CTCs的轉(zhuǎn)移、固定和釋放。

圖2 細(xì)胞分選和釋放的可行性

接著，研究人員對(duì)一系列實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。在最優(yōu)的條件下，細(xì)胞捕獲、分選和釋放效率分別為84%、89%和94%（圖3A）。此外，研究人員考察了方法在PBS和血漿基質(zhì)中對(duì)CTCs的回收率，從圖3B可以看出，不同密度CTCs下，兩種基質(zhì)中的細(xì)胞回收率都相對(duì)穩(wěn)定且保持較高水平（75% ~ 80%），展現(xiàn)了該方法較強(qiáng)的抗基質(zhì)干擾能力。通過(guò)AO/EB雙染實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了所回收CTCs的細(xì)胞活性，存活率高達(dá)99.3%。隨后，研究人員探究了該方法的特異性，如圖4所示，結(jié)果表明本方法對(duì)EpCAM表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞具有良好的特異性，同時(shí)對(duì)EpCAM表達(dá)陰性的細(xì)胞具有較強(qiáng)的抵抗力。

圖3 （A）最佳條件下MCF-7細(xì)胞在PBS中的細(xì)胞捕獲、分選和釋放效率；（B）不同密度MCF-7細(xì)胞在PBS和血漿中的細(xì)胞回收率

圖4 方法特異性

為了驗(yàn)證該方法在實(shí)際血樣中的分析能力，在實(shí)際血樣中加標(biāo)不同數(shù)量的MCF-7細(xì)胞，采用本方法測(cè)定了加標(biāo)血樣中MCF-7細(xì)胞的個(gè)數(shù)。從圖5A中可以看到，檢測(cè)到的MCF-7細(xì)胞的個(gè)數(shù)與加標(biāo)的MCF-7細(xì)胞的個(gè)數(shù)呈較好的相關(guān)性，表明該方法具備良好的臨床應(yīng)用潛力。最后，將所構(gòu)建的方法用于16名乳腺癌患者和4名健康人全血樣本檢測(cè)。如圖5B ~ 5C所示，在16例患者中，CTCs均有檢出（6 ~ 241個(gè)/mL），且明顯高于健康人血液中的平均CTCs個(gè)數(shù)（0.5個(gè)/mL）。


圖5 （A）不同數(shù)量MCF-7細(xì)胞血樣加標(biāo)的ICP-MS檢測(cè)結(jié)果；16例乳腺癌患者和4例健康人1 mL全血中CTCs計(jì)數(shù)的（B）柱狀圖和（C）箱形圖

綜上所述，本工作設(shè)計(jì)了一種基于磁性探針的級(jí)聯(lián)相轉(zhuǎn)移微流控芯片，用于CTCs的分選、純化和釋放，通過(guò)ICP-MS測(cè)定細(xì)胞內(nèi)源性元素鋅（Zn），實(shí)現(xiàn)了CTCs細(xì)胞的高靈敏度檢測(cè)。這種微流控芯片設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，集成化高，既包含適配體修飾磁性探針介導(dǎo)下的主動(dòng)分選，又包含螺旋通道和鋸齒凹槽引起的被動(dòng)分選。

此外，在所設(shè)計(jì)的微流控芯片中，CTCs發(fā)生級(jí)聯(lián)相轉(zhuǎn)移，從樣品相轉(zhuǎn)移至PBS實(shí)現(xiàn)分離和純化，再轉(zhuǎn)移至核酸酶溶液中實(shí)現(xiàn)釋放，其CTCs的分選、純化和釋放效率高。在實(shí)際血樣中，CTCs的加標(biāo)回收率為84%，白細(xì)胞的數(shù)量從10?數(shù)量級(jí)減少至100個(gè)左右。所建立方法被成功地應(yīng)用于乳腺癌患者血液樣本中CTCs的檢測(cè)。此外，采用內(nèi)源性元素標(biāo)簽策略和從細(xì)胞表面溫和去除磁性探針顯著提高了細(xì)胞活力，回收的細(xì)胞活性高達(dá)99.3%。綜上所述，所構(gòu)建的方法在癌癥的早期診斷、腫瘤進(jìn)展監(jiān)測(cè)和腫瘤預(yù)后評(píng)估等臨床應(yīng)用方面表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。

審核編輯：劉清