十偏振分辨倍頻顯微鏡及其圖像處理介紹的詳細(xì)說明

　　在非線性光學(xué)顯微鏡中，二倍頻（SHG）成像通常用于觀測內(nèi)源性纖維狀結(jié)構(gòu)，且 SHG 的強(qiáng)度很大程度上取決于入射光束的偏振方向與目標(biāo)分子取向軸之間的相對角度。因此，基于偏振的 SHG 成像（P－SHG），可通過分析 SHG 信號強(qiáng)度與入射光束的偏振態(tài)之間的函數(shù)關(guān)系，來獲得目標(biāo)分子的結(jié)構(gòu)信息。其現(xiàn)在已用作醫(yī)學(xué)和生物學(xué)分析的重要工具。簡單的 SHG 圖像可以通過傳統(tǒng)的雙光子激發(fā)熒光顯微鏡（TPM）獲得。大多數(shù) TPM 系統(tǒng)仍采用基于運(yùn)動鏡面的單束掃描方法，其時間分辨率取決于鏡面的物理移動速度。為了實現(xiàn)更高速的成像，TPM 系統(tǒng)還可以采用多束掃描的方法（圖 1A），其中之一便是利用轉(zhuǎn)盤掃描單元。該單元由共軸的微透鏡轉(zhuǎn)盤和針孔轉(zhuǎn)盤構(gòu)成，兩個轉(zhuǎn)盤上的微透鏡和針孔一一對應(yīng)。激光在通過微透鏡轉(zhuǎn)盤時，波前會覆蓋多個微透鏡，不同微透鏡將波前各部分聚焦到不同的位置，并穿過對應(yīng)的針孔，形成多個微光束。這些微光束打到樣品上，可同時激發(fā)多個信號。這些信號沿顯微鏡系統(tǒng)返回并再次穿過針孔，最后被兩個轉(zhuǎn)盤之間的二向色鏡反射到檢測裝置中。然而，常規(guī)使用的鎖模鈦寶石激光器作為光源能量不足，限制了激發(fā)光束的數(shù)量，導(dǎo)致使用轉(zhuǎn)盤掃描單元的 TPM （TPM－SD） 的有效視場 （FOV） 很小。 Ai Goto 等人想通過 TPM－SD 系統(tǒng)實現(xiàn)高速的 P－SHG 成像，并保證大的 FOV，故在 TPM－SD 系統(tǒng)中引入了峰值功率更高的基于 Yb 的激光光源。圖 1 是他們開發(fā)的 TPM－SD 系統(tǒng)示意圖。該系統(tǒng)光源為基于 Yb 的激光器，產(chǎn)生的飛秒脈沖中心波長為 1042 nm、平均功率 4 W、脈寬 300 fs，重復(fù)頻率 10 MHz。系統(tǒng)首先通過半波片和格蘭激光偏振器來調(diào)節(jié)激光功率，接著通過擴(kuò)束器進(jìn)行擴(kuò)束，擴(kuò)束后的光束被引入到轉(zhuǎn)盤掃描單元中，接著從掃描單元出來的多個微光束通過水浸物鏡被聚焦在樣品的多個點(diǎn)上。為了調(diào)整光束在物鏡處的偏振態(tài)，激發(fā)光束的光路上放置了一個半波片和一個四分之一波片。為了測量樣品上入射光束的偏振態(tài)，在物鏡后端放置了一個線性偏振膜。在這項研究中，他們使用了圓偏振光（圖 1B；橢圓度 0．95）和 4 種線偏振光束（圖 1C－F；橢圓度 0．2－0．3）。以 FOV 的水平軸為基準(zhǔn)，將橫向偏振角設(shè)置為 0、45、 90 和 135°。物鏡收集到的熒光或 SHG 光通過針孔轉(zhuǎn)盤，被二向色鏡反射至偏振分束器。偏振分束器將信號分離為一對偏振分辨信號，它們被放大倍數(shù)為×1．2 的中繼透鏡分別聚焦在電子倍增 CCD 相機(jī)的不同方形檢測區(qū)域上，從而同時獲取一對矩形圖像。軸向掃描是通過壓電驅(qū)動器實現(xiàn)的。